Кратка палиндромска понављања са груписаним регуларним размаком (CRISPR) су техника уређивања генома треће генерације која је револуционисала свет својим високопропусним резултатима. Коришћена је за лечење разних биолошких болести и инфекција. Различите бактерије и други прокариоти (као што су археје) такође имају CRISPR/Cas9 системе за одбрану од фага. Пријављено је да стратегије засноване на CRISPR/Cas9 могу инхибирати раст и прогресију троструко негативног рака дојке (TNBC) циљањем потенцијално измењених гена отпорности, транскрипције и епигенетске регулације. Ове терапијске интервенције могу помоћи у решавању изазовних проблема као што је резистенција на лекове која се примећује чак и код TNBC. Тренутно се користе различите методе за испоруку CRISPR/Cas9 циљним ћелијама, као што су физичке (микроињекција, електропорација и хидродинамички режими), вирусне (адено-асоцирани вирус и лентивирус) и невирусне (липозоми и липидне наночестице). Иако су развијени различити модели за проучавање молекуларних узрока TNBC-а, недостатак осетљивих и циљаних метода за испоруку алата за уређивање генома in vivo ограничава њихову клиничку примену. Укратко, овај преглед свеобухватно испитује напредак, изазове, ограничења и перспективе CRISPR/Cas9 третмана за TNBC на основу постојећих доказа. Такође истичемо како комбинација вештачке интелигенције и машинског учења може побољшати CRISPR/Cas9 стратегије у лечењу TNBC-а.
Рак карактерише неконтролисана деоба ћелија, поремећај контролних тачака ћелијског циклуса и мутације у генима супресора тумора (TSG) (Matthews et al., 2022). Међу различитим врстама рака, рак дојке је најчешћи тип рака код жена и има високу стопу смртности широм света (Waks and Winer, 2019). Рак дојке је хетерогена болест са различитим карактеристикама, као што су хистолошке и биолошке карактеристике, клиничка презентација и понашање, и одговор на лечење (Weigelt et al., 2010). Класификација рака дојке пружа прецизан увид за дијагнозу рака дојке и прогнозу тумора. Употреба уобичајених биомаркера и клиничко-патолошких карактеристика била је главни критеријум за класификацију рака дојке (Tsang and Tse, 2019). На прогнозу и одговор на лечење рака дојке утичу бројни фактори, укључујући присуство рецептора естрогена (ER), рецептора прогестерона (PR), рецептора 2 хуманог епидермалног фактора раста (HER2/neu), као и хистолошки градус, тип и величину тумора и метастазе у лимфним чворовима (Al-Tubaiti, 2020). Идентификовано је пет интринзичних молекуларних подтипова рака дојке, укључујући луминални А, луминални Б, HER2-обогаћен, базални-сличан и са ниском концентрацијом клаудина (Prat et al., 2015). TNBC је молекуларни подтип рака који не експресује све ER, PR и HER2 (Yin et al., 2020). Ове патолошке карактеристике су повезане са TNBC, што потврђује његову брзу прогресију и агресивнију природу од било које друге врсте рака дојке (Feng et al., 2018). Поред тога, Peru et al. (2000) су користили технологију микрочипова за рекласификацију рака дојке и идентификовање пет интринзичних подтипова рака дојке (Cadenas, 2012). Базални-сличан рак дојке је подтип рака дојке који има троструко негативан фенотип и повезан је са брзом прогресијом. Треба напоменути да се сви базални-слични карциноми дојке често погрешно дијагностикују као TNBC, али само 77% су TNBC; Насупрот томе, 71–91% TNBC су базалног типа, што указује на то да се ова два типа рака дојке преклапају и представљају различите класификације (Wang D.-Y. et al., 2019). Ово ствара потребу за карактеризацијом хетерогености TNBC како би се разјаснила прогноза и идентификовали потенцијални одговори на тренутне и будуће третмане. Поред тога, TNBC чини 15–20% свих случајева рака дојке и чешћи је код жена млађих од 50 година. Мутације BRCA1 или BRCA2 су пријављене у приближно 20% случајева TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). Студије су такође показале да TNBC има посебну имунолошку микроокружење која укључује високе нивое фактора раста васкуларног ендотела, макрофаге повезане са тумором (TAM), лимфоците који инфилтрирају тумор (TIL) и друге молекуле укључене у раст и миграцију тумора. Стога је разумевање микроокружења TNBC-а кључно за његову прогнозу и лечење (Fan and He, 2022).
Да би се проценила прогноза TNBC и обезбедило ефикасно лечење, важна је тачна дијагноза, углавном заснована на имунохистохемији (IHC) за откривање ER, PR и HER2, и мамографија за откривање неоплазми дојке. Међутим, мамографија не може адекватно да прикаже интратуморалне карактеристике као што су некроза и фиброза (Deepak Singh et al., 2021). Пошто лоша прогноза и дијагноза спречавају лекаре да пропишу праве лекове (Chaudhary, 2020), користе се различите стратегије за побољшање неге пацијената са TNBC. Тренутно се два лека, доксорубицин и циклофосфамид, користе код пацијената са TNBC и показали су добре резултате. Поред тога, користе се и други лекови на бази платине, као што су карбоплатин и цисплатин (Sikov et al., 2015). Поред тога, инхибитори PARP као што су Olaparib, Velaparib и PF-01367338 коришћени су као потенцијални хемотерапијски лекови за лечење TNBC (Ishino et al., 2018). Пошто је објављено да су Wnt/b-Catenin, NOTCH и Hedgehog сигнални путеви укључени у настанак и прогресију TNBC-а, циљање лекова на ове путеве може бити важна стратегија (Aysola et al., 2013). Иако хирургија, радиотерапија и хемотерапија остају главни ослонац лечења TNBC-а данас, постигнут је значајан напредак у развоју нових третмана, укључујући циљану терапију, имунотерапију, различите алате за уређивање гена повезане са CRISPR-ом, као што су Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, примарно уређивање и CRISPR/Cas9-циљана генска терапија. Овде ћемо се фокусирати на различите алате за уређивање гена повезане са CRISPR-ом који се користе у лечењу TNBC-а. Међу њима, CRISPR/Cas9 је добио широку пажњу.
Cas9n, такође познат као Cas9 никаза, је генетски модификована варијанта Cas9 протеина изведена из CRISPR/Cas9 система за уређивање генома (Gupta et al., 2019). У свом оригиналном облику, Cas9 протеин садржи два нуклеазна домена: RuvC и HNH, чија је главна функција цепање оба ланца ДНК. Међутим, код Cas9n, један од нуклеазних домена, HNH, је генетски мутиран и постаје неактиван. Стога, HNH домен Cas9n остаје нефункционалан. Само RuvC домен остаје активан, што омогућава Cas9n да сече или ствара прекиде на појединачним ланцима ДНК (Trevino and Zhang, 2014). У поређењу са Cas9, Cas9n може ефикасно смањити ефекте ван циља и прецизно побољшати механизме поправке ћелија. Cas9n се може користити за решавање различитих проблема, као што је стварање прекида на одређеним локацијама у дволанчаној ДНК. У ту сврху, два Cas9n молекула су комбинована и коришћена заједно (Yee, 2016). Мешовита линија киназе 3 (MLK3) је митогеном активирана протеин киназа која служи као кључни регулатор током метастаза TNBC (Cronan et al., 2012).
МЛК3 може активирати више сигналних путева који доводе до метастаза TNBC. На пример, пут c-Jun N-терминалне киназе (JNK) регулише покретљивост ћелија и разградњу екстрацелуларног матрикса, а МЛК3 активира JNK пут, чиме побољшава покретљивост ћелија и даје инвазивна својства (Rattanasinchai and Gallo, 2016). МЛК3 такође регулише EMT. Да би то урадио, активира низводне транскрипционе факторе као што су Snail, Slug и Twist. Ови фактори инхибирају експресију епителних маркера и промовишу експресију мезенхималних маркера, што доводи до стицања метастатског фенотипа (Casalino et al., 2023). Примећено је да МЛК3 игра улогу у ремоделирању ECM и активацији протеаза као што су матриксне металопротеиназе (MMP) које разграђују ECM. Ово олакшава инвазију ћелија тумора и ширење на удаљена места (Katari et al., 2019). Дакле, претходне студије су показале да МЛК3 игра кључну улогу у TNBC. Ратанасинчаи и Гало су користили TNBC моделе да би проучили улогу MLK3 и открили да он подстиче развој рака путем специфичних сигналних путева. Користили су CRISPR/Cas9n за уређивање MLK3 и приметили значајно смањење метастаза TNBC (Rattanasinchai and Gallo, 2016).
dCas9, често назван неактивни Cas9, је модификовани дериватни облик Cas9 протеина. За разлику од активног Cas9, dCas9 нема ендонуклеазну активност, што га чини неспособним да индукује двоструке прекиде ДНК. Стога се dCas9 може користити за прецизно циљање специфичних региона генома без икаквих промена или модификација ДНК секвенце (Wang et al., 2016). У dCas9, два ендонуклеазна протеина, RuvC и HNH, су инактивирана сузбијањем важних аминокиселинских остатака. (Richter et al., 2016). Упркос недостатку активности цепања ДНК, dCas9 игра бројне важне улоге у генетским истраживањима и биотехнологији. На пример, омогућава визуелизацију специфичних региона генома, олакшава транскрипциону регулацију и промовише епигенетске модификације (Brocken et al., 2018).
Транскрипциони фактор ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) игра специфичну и критичну улогу у посредовању епително-мезенхималне транзиције (EMT), ћелијског процеса који се одвија током ембрионалног развоја, поправке ткива и прогресије рака. Он укључује трансформацију епителних ћелија у мезенхималне ћелије, што резултира променама у ћелијској морфологији, покретљивости, инвазивности итд. (Wu et al., 2020). ZEB1 инхибира вишеструке епителне маркере, као што су Е-кадхерин и оклудин, који су одговорни за одржавање ћелијске адхезије и поларитета епителних ћелија код TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Поред тога, ZEB1 активира одређене маркере као што су N-кадхерин, виментин и фибронектин (Konradi et al., 2014), а такође регулише гене укључене у ремоделирање цитоскелета као што су Rho GTPases и матрикс металопротеиназе (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), поред тога, такође утиче на различите сигналне путеве као што су трансформишући фактор раста-β (TGF-β), Wnt сигнализација итд., чиме се подстиче инвазија тумора и метастазе код TNBC (Chen et al., 2016). Бројне студије и научни докази указују да ZEB1 има велики потенцијал као вредно средство за детекцију и терапијску интервенцију TNBC. У недавној студији, Waryah et al. користили су TNBC модел и постигли потпуну супресију ZEB1 помоћу dCas9. Тако су приметили веома високу специфичност и скоро потпуну инхибицију ZEB1 у in vivo условима (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 је алат за уређивање гена под називом CRISPR/Cpf1. Изведен је из CRISPR/Cas система, где се термин Cas12 односи на CRISPR-асоцирани протеин 12 (Bharathkumar et al., 2022), који је потпуно сличан Cas9. Једина разлика је што садржи протеин Cas12. У поређењу са Cas9, Cas12 има неке јединствене функције као што је генерисање лепљивих крајева током процеса уређивања гена, док Cas9 генерише тупе крајеве (Wang et al., 2021). Ово својство Cas12 доприноси његовој специфичној технологији манипулације ДНК. Као протеин способан да прецизно препозна и сече циљну ДНК, поседује изузетну свестраност, што га чини ефикасним алатом за разне примене, укључујући уређивање гена (Pickar-Oliver и Gersbach, 2019).
Слично другим варијантама CRISPR-а, CRISPR/Cas12 је такође способан да нокаутира или активира гене у TNBC-у, циљајући гене који играју важну улогу у његовој патогенези или одговору на лечење (Yang and Zhang, 2023). Да би се овај процес остварио, развијена је водиља РНК (gRNA) која усмерава Cas12 ка циљном гену. Када се Cas12 веже за своју мету, она уводи дволанчане прекиде у ДНК и активира механизме поправке ДНК. Током процеса поправке, могу се уградити погрешни нуклеотиди, што доводи до мутација гена и губитка функције (Zhang et al., 2021a). Поред тога, побољшана верзија ензима Cas12 (названа dCas12) је такође коришћена за активацију гена. Комбиновањем са активатором транскрипције, могуће је индуковати одређене гене, чиме се активирају. Ова технологија има велики потенцијал у промоцији активације гена супресора тумора (Sultan et al., 2022).
Примарно едитовање је новоразвијена и изузетно супериорна технологија едитовања генома. Способна је да веома прецизно модификује ДНК организма (Chen and Liu, 2023). Примарно едитовање се постиже интеграцијом две главне компоненте: модификованог ензима CRISPR/Cas9 и реверзне транскриптазе. Улога ензима CRISPR/Cas9 је да селективно циља прецизна места у геному, док реверзна транскриптаза помаже у темељној модификацији ДНК на циљној локацији (Hassan et al., 2021). У механизму едитовања прајмера, први корак укључује стварање РНК водича за едитовање прајмера (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Она садржи циљну секвенцу и РНК шаблон који одговара жељеном месту едитовања у циљној ДНК. PegRNA се затим уноси у циљне ћелије заједно са нуклеазом за едитовање прајмера (PE2). PE2 је фузиони протеин који се састоји од ензима Cas9, реверзне транскриптазе и адаптера за едитовање прајмера (Martín-Alonso et al., 2021). Унутар ћелије, пегРНК и ПЕ2 комплекси траже специфичну ДНК коју желе да модификују. Ензим Cas9 сече ДНК и ствара шаблон који се састоји од појединачних ланаца (Choi et al., 2022). Реверзна транскриптаза користи овај шаблон за припрему ДНК за уређивање. Уз копирање ДНК, укључена су и упутства за уређивање РНК шаблона. Коначно, новостворени ланац ДНК се користи као шаблон за поправку прекида у ДНК, што резултира измењеном ДНК секвенцом која садржи жељену модификацију (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Механизми уређивања прајмера могу довести до широко распрострањених мутација у генима. Може циљати тачкасте мутације, инсерције, делеције, па чак и замене гена (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). Уређивање прајмера нуди неколико предности у односу на претходне технологије уређивања генома. То укључује повећану тачност, смањене ефекте ван циља и могућност уређивања ДНК без ослањања на двоструке прекиде ДНК (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9 технологија је првобитно развијена да заштити бактерије од преноса плазмида и фаг инфекције, а касније је пренамењена као ефикасан алат за циљање ДНК заснован на РНК за уређивање генома (Jiang и Doudna, 2017). Поред тога, објављено је да је CRISPR/Cas9 систем присутан у 50% и 87% бактеријских и архејских генома, респективно (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 је потенцијални алат за брисање, уметање и корекцију било које абнормалне генетске секвенце коришћењем in vivo и in vitro режима (Sabit et al., 2021). Штавише, показало се да је CRISPR/Cas9 део адаптивног имуног система због своје специфичности за циљне гене од интереса (Chen и Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 се састоји од Cas9 и једне водиљске РНК (sgRNA). Cas9 је ендонуклеаза састављена од више протеинских компоненти. Поред тога, Cas9 има јединствена структурна и конформациона својства (Pacesa et al., 2022) јер се састоји од два режња: препознавања (REC) и нуклеазе (NUC). REC режањ је даље подељен на три региона: REC1, REC2 и мостовне хеликсе (Cromwell et al., 2018). NUC се састоји од три режња, наиме RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH и интеракционог домена суседног мотива протоспејсера (PAM) (Слика 1) (Song et al., 2016). sgRNA се састоји од две компоненте, укључујући CRISPR РНК (crRNA) и транскодирајућу малу РНК (трасер РНК) (Слика 1). sgRNA повезује Cas9 протеин са конексинима и формира активни комплекс, такође познат као ефекторски комплекс (Richter et al., 2012). crRNA је базни пар од 18–20 нуклеотида који игра кључну улогу у препознавању циљних ДНК секвенци. Поред тога, crRNA се упарује са циљном ДНК, а tracrRNA делује као скела за Cas9 нуклеазу да се веже за циљну ДНК (Manghwar et al., 2019). С друге стране, PAM секвенца има 3 нуклеотида, што потврђује, специфицира и посредује везивање ефекторског комплекса за ДНК. Подјединице RuvC и HNH протеинског комплекса Cas9 имају каталитичку активност (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021). HNH нуклеазни домен Cas9 подјединице цепа ДНК ланац повезан са crRNA. Нуклеазни домен RuvC цепа друге ланце ДНК и генерише дволанчане прекиде (DSB), након чега се активирају два различита механизма поправке прекида ДНК (Jiang и Doudna, 2017) (Слика 1).
Слика 1. Преглед CRISPR/Cas9 (А). Компоненте CRISPR/Cas9 система: (i). Cas9 ендонуклеаза је одговорна за сечење циљне ДНК секвенце, (ii) једна водиља (sg) РНК која настаје фузијом crRNA и tra-crRNA химера. (две). Cas9 укључује неколико компоненти као што су Rec I, Rec II, NUC режањ (HNH и Ruv C су подкомпоненте) и PAM интеракциони домен (C) са одговарајућим функцијама. CRISPR/Cas9 протеински комплекс цепа ДНК секвенце у некомплементарне и комплементарне облике (D). CRISPR/Cas9 уређује геном у три фазе: препознавање, сечење и поправка. Дизајнирана sg-РНК води Cas9 и препознаје жељену секвенцу кроз комплементарну компоненту crRNA. Cas9 препознаје PAM секвенцу на 5′-NGG-3′ и топи ДНК, формирајући ДНК-РНК хибрид и активирајући цепање. HNH домен Cas9 цепа комплементарни ланац, а RuvC домен цепа некомплементарни ланац. CRISPR/Cas9 поправља дволанчану ДНК тако што је прекида на два начина: спајањем нехомологних крајева (NHEJ) и поправком усмереном на хомологију (HDR). NHEJ поправља дволанчану ДНК у одсуству стране хомологне ДНК путем ензимског процеса, механизма склоног грешкама који може да убаци или уклони насумичне ДНК секвенце. HDR је веома специфичан и захтева хомологне ДНК шаблоне.
CRISPR/Cas9-посредовани путеви поправке укључују механизме нехомологног спајања крајева (NHEJ) и хомологијом усмерене поправке (HDR). NHEJ је пут склон грешкама јер укључује уметање или делецију и не захтева никакав образац током механизма поправке. Користи насумичне нуклеотиде за генерисање стандардних протеина (Abbasi et al., 2021). Овај систем поправке састоји се од четири комплекса као што су KU комплекс, унакрсно комплементирајући протеински комплекс типа 4 (XRCC-4), ензим за обраду крајева ДНК и протеин киназа DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Протеин KU комплекса има две подјединице, Ku 70 и Ku 80, и игра важну улогу у NHEJ механизму, будући да се механизам поправке покреће везивањем две подјединице (Ku 70 и Ku 80) за тупе или скоро тупе крајеве циљне ДНК (Abbasi et al., 2021), служећи као скела за регрутовање других фактора повезаних са NHEJ на место повреде (Yang et al., 2020). XRCC-4 и ДНК лигаза се састоје од 334 и 911 аминокиселина, респективно, а комплекс XRCC4-ДНК лигазе IV стимулише лигацију ДНК крајева (Chatterjee et al., 2015). Ензим за обраду ДНК крајева, такође познат као полинуклеотид киназа 3′-фосфат, је ензим за обраду ДНК крајева. Може уклонити 3′P групу у ДНК и фосфориловати 5′OH групу током поправке DSB. Такође укључује поправку једноланчаних прекида (SSB) коришћењем SSB пута поправке (Chatterjee et al., 2015). Протеин киназа DNA-PKcs је ДНК-зависна протеин киназа која се састоји од каталитичке подјединице PIKK-ова (фосфатидилинозитол 3-киназа-сродних киназа) и породице атаксије телеангиектазије мутиране (ATM), као и ATR-ова повезаних са ATM и Rad3, прекида ланца (DSB) и једноланчаних прекида (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR је прецизнији и погоднији механизам поправке јер се информације копирају коришћењем интактног облика хомологног ДНК дуплекса, иако је потребно присуство сестринских хроматида. Ово се дешава током S/G2 фазе ћелијског циклуса сисара. HDR се јавља углавном код врста квасца, али је NHEJ критичан код сисара (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Комплетан механизам поправке је приказан на слици 1.
Пошто је TNBC узрокован генетским и епигенетским абнормалностима, корекција малигних геномских/епигеномских абнормалности коришћењем CRISPR/Cas9 може бити разуман терапијски приступ (Chen et al., 2019). Поред тога, неки транскрипциони фактори укључени у ћелијски специфичну транскрипциону регулацију могу показивати јединствене карактеристике ћелија рака, што сугерише да транскрипциона регулација може бити одличан приступ лечењу рака (Drost et al., 2017). Искоришћавање ових молекуларних карактеристика тумора, као што су генетски, епигенетски и транскрипциони дефекти, за развој лекова може побољшати клиничке исходе и смањити трошкове скрининга. CRISPR је потенцијални алат за уређивање гена који не само да може да детектује и идентификује геномске циљеве који изазивају рак, већ се може користити и за уређивање, сузбијање и епигенетску модификацију онкогена у људским ћелијама (Табела 1) (Ahmed et al., 2021). Спроведено је неколико CRISPR скрининга како би се тражили гени повезани са супресорима тумора, онкогенима и резистенцијом на лекове. Употреба CRISPR/Cas9 за уређивање различитих онкогена TNBC приказана је на слици 2.
Слика 2. Генско уређивање различитих онкогена TNBC коришћењем CRISPR/Cas9 што резултира смањеним растом тумора и метастазама. Ови онкогени укључују CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 и CXCR7, Crypto1, ROR1 и ST8SIA, који су укључени у настанак и метастазе TNBC.
Миграција, инвазија ћелија рака и епително-мезенхималне транзиције (ЕМТ) повезане су са ITGA9. Претходне студије су показале да је ITGA9 кључни играч у Notch путу и игра занимљиву улогу у метастазама рабдомиосаркома (Molist et al., 2020). Поред тога, утврђено је да је ITGA9 уско повезан са прогнозом пацијената код неколико типова тумора, укључујући рак дојке (Wang Z. et al., 2019). Поред тога, биоинформатичка анализа ITGA9 показала је да је његова експресија у TNBC значајно већа него код других подтипова рака дојке. Повишени нивои ITGA9 повезани су са метастазама тумора и рецидивом код пацијената са TNBC. Нокаут ITGA9 помоћу CRISPR/Cas9 резултирао је својствима сличним матичним ћелијама рака (CSC), ангиогенезом тумора, растом тумора и смањењем метастаза промовисањем разградње β-катенина у TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Крипто-1 је члан породице TGF-β и кључан је за рану ембриогенезу, одржавање матичних ћелија и метастазе рака (Ishii et al., 2021). Такође познат као Tdgf-1, то је онкогени GPI-усидрени сигнални протеин који је укључен у регулацију формирања примитивне пруге, мезодерма и ендодерма, као и успостављање лево/десне асиметрије у развоју органа тела током ембриогенезе (Zhang et al., 2021b). Поред тога, показано је да је Крипто-1 укључен у епително-мезенхималну транзицију (EMT) као маркер матичних ћелија (Zhang et al., 2021b). EMT је кључан не само за различите процесе као што су ембрионални развој, фиброза и зарастање рана, већ и за инвазију и метастазе рака. Поред тога, показано је да Крипто-1 интерагује са четири Notch рецептора и побољшава њихово посттранслационо сазревање (Brandstadter and Maillard, 2019). Познато је да је Notch сигнални пут укључен у одржавање ћелија рака дојке код људи. Студије су показале да CRISPR/Cas9-посредовано нокаутирање Crypto-1 сузбија раст и метастазе рака. Стога, Crypto-1 може постати важна терапијска мета за TNBC (Castro et al., 2015).
Протеин XCL12 и његов хемокински рецептор CXC (CXCR4 и CXCR7) играју различите улоге у пролиферацији, расту, миграцији и инвазији ћелија рака (Wu et al., 2015). Ови хеморецептори су повезани са развојем TNBC кроз вишеструке сигналне путеве и у in vivo и у in vitro моделима (Wu et al., 2015). Поред тога, активација CXCR4 и CXCR7 је повезана са већом подложношћу метастазама и лошом прогнозом код TNBC (Karn et al., 2022). Стога, нокаут CXCR4 и CXCR7 могу постати ефикасни циљни гени лекова за лечење рака дојке, укључујући TNBC. Студија Јанг и др. Јанг и др. (2019) користили су CRISPR/Cas9 за ко-нокаутирање гена CXCR4 и CXCR7 и открили да су пролиферација, раст, миграција и инвазија TNBC значајно инхибирани (Yang et al., 2019).
Повећани нивои miR-3662, онкогена TNBC, примећени су у ткивима рака дојке (Yi et al., 2022). Показано је да обарање miR-3662 инхибира раст и метастазе тумора рака дојке и in vivo и in vitro (Agarwal and Gupta, 2021). HBP-1 је снажан инхибитор Wnt/-катенин сигнализације и вероватно је одговоран за раст TNBC ћелија посредован miR-3662. Недавно су Yi et al. открили да оса miR-3662-HBP1 регулише Wnt/-катенин сигнални пут у TNBC ћелијама (Yi et al., 2022). Због своје тумор-специфичне експресије, miR-3662 може бити потенцијална терапеутска мета за TNBC. Стога, обарање miR-3662 посредовано CRISPR/Cas9 може бити одличан приступ за развој нових лекова за лечење TNBC.
UBR5 је нуклеофосфопротеин од 300 kDa који је идентификован као кључни регулатор туморогенезе, метастаза и имуног одговора код различитих врста рака (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Пријављено је да је UBR5 високо појачан у узорцима TNBC и стимулише ERα функцију индукујући пролиферацију путем своје убиквитин лигазне активности (Bolt et al., 2015). Студије секвенцирања целог ексома примарних узорака TNBC такође су показале повећану експресију UBR5, што указује на његову улогу у развоју TNBC. Поред тога, делеција UBR5 изазвана CRISPR/Cas9 показала је значајну инхибицију метастаза и раста TNBC у експерименталним моделима мишева. Штавише, укључивање UBR5 у модел миша дивљег типа вратило је његову пуну функционалност, док овај ефекат није примећен код инактивираних мутантних сојева (Liao et al., 2017). Недостатак UBR5 је повезан са повећаном апоптозом, некрозом и инхибицијом раста тумора код TNBC због лоше ангиогенезе. Због губитка UBR5, ширење тумора на удаљене органе је смањено, а UBR5 индукује абнормални EMT углавном смањењем експресије Е-кадхерина (Zhang и Weinberg, 2018). Недавно се показало да је UBR5 веома важан фактор у IFN-γ-индукованој транскрипцији PDL1 код TNBC због недостатка активности убиквитинације E3. Анализа РНК транскриптома је открила да UBR5 може имати системске ефекте на гене повезане са IFN-γ путем и промовисати трансактивацију PDL1 повећавањем нивоа активације протеин киназе РНК (PKR) и њених сигналних претварача и активатора транскрипције 1 (STAT1) и регулаторног фактора интерферона 1 (IRF1). Међутим, комбинована аблација UBR5 и експресије PD-L1 посредована CRISPR/Cas9 има синергистички терапеутски ефекат него било која блокада појединачно, са дубоким ефектима на микроокружење тумора (Wu et al., 2022). Стога, CRISPR/Cas9 може бити важан алат за инхибицију функције UBR5, чиме се сузбијају метастазе TNBC-а и раст тумора.
ROR1 је трансмембрански протеин типа I који се експресује током рака и ембрионалног развоја и идентификован је као онкофетални протеин (Nicholas Borcherding, 2014). Инвазивно понашање различитих врста рака код људи повезано је са повећаном регулацијом ROR1. Обећавајући резултати су добијени из in vivo и in vitro студија које укључују терапијска једињења која циљају ROR1 (Chien et al., 2016). Повишени нивои ROR1 mRNA у биопсијама ткива дојке такође су повезани са агресивним базалним туморима дојке (BL) и њиховом миграцијом у друге делове тела. Штавише, прекомерна експресија ROR1 је идентификована као прогностички маркер за развој TNBC (Chien et al., 2016). Међутим, утишавање ROR1 помоћу CRISPR/Cas9 ради сузбијања раста и метастаза TNBC била би ефикасна стратегија.
Процес сијалилације укључује додавање сијалинске киселине гликокоњугатима, што катализују сијалилтрансферазе (СТ). ST8SIA1 припада породици СТ и игра важну улогу у патогенези разних болести као што су лимфоцитна леукемија и колоректални карцином (Chang et al., 2018). Анализа РНК секвенце показује да је ST8SIA1 високо експресован у ткиву дојке пацијената са TNBC и да је позитивно корелиран са мутацијама у гену супресора тумора p53, што може допринети патогенези TNBC (Battula et al., 2017). Поред тога, ST8SIA1 је укључен у метастазе и рецидив TNBC, што сугерише да игра важну улогу у појави и развоју TNBC. У ин витро моделу TNBC, показано је да обарање ST8SIA1 помоћу CRIPSR/Cas9 блокира раст и метастазе (Battula et al., 2017). Ово сугерише да CRISPR/Cas9 може бити важан алат за инхибицију функције онкогена ST8SIA1 у лечењу TNBC.
NAT1 је метаболички ензим који катализује формирање ксенобиотских једињења фазе II и експресује се у скоро свим људским ткивима. NAT1 може да користи кофактор фолат за циљање ацетил-CoA (ацетил-CoA) чак и у одсуству ароматичног аминског супстрата (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Студије су показале да NAT1 регулише функцију матрикс металопротеиназе 9 (MMP9) у моделима ћелија рака дојке и штити од реактивних врста кисеоника (ROS) током гладовања глукозом (Wang et al., 2018). Показано је да делеција NAT1 инхибира комплекс пируват дехидрогеназе, што доводи до митохондријалне дисфункције (Wang L. et al., 2019). Поред тога, разни други извештаји су показали да инхибиција NAT1 коришћењем малих молекула и утишавања siRNA може смањити инвазивност и пролиферацију ћелија рака дојке (Stepp et al., 2018). Недавно је CRISPR/Cas9 коришћен за сузбијање NAT1 у ћелијској линији рака дојке MDA-MB-231, утичући на ћелијски метаболизам у зависности од нивоа експресије. Ова студија је такође показала да је NAT-1 кључан за прогресију и метастазирање TNBC (Carlisle et al., 2020).
Координисана транскрипција онкогена регулисана је супер-енхансерима, транскрипционим факторима и кофакторима (Hnisz et al., 2015). Поред тога, група циклин-зависних киназа (CDK), као што су CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 и CDK13, неопходне су за транскрипциону регулацију. Међу њима, CDK7 је укључена у фосфорилацију РНК полимеразе II, што је веома важно за покретање и ширење транскрипције онкогена у патогенези TNBC. У једној преломној студији, делеција CDK7 помоћу CRISPR/Cas9 инхибирала је TNBC, што указује да је патогенеза TNBC зависна од CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Студије су показале да мутације у MYC и RBP (протеин који везује РНК) могу довести до апоптозе, док појединачне генске мутације у MYC или RBP не утичу на раст ћелија рака (Einstein et al., 2021). Више од 1000 RBP у људском геному је скринирано коришћењем библиотеке засноване на CRISPR/Cas9. Међу њима, утврђено је да је 57 RBP критично за раст ћелија рака са високо повишеним нивоима MYC (Wheeler et al., 2020). Поред тога, YTHDF2 је важан за одржавање раста ћелија TNBC и смањује количину метилираних транскрипата током транскрипције и транслације на високом нивоу у ћелијама рака са вишом експресијом MYC. Поред тога, YTHDF2 није неопходан за ћелије рака, које су мање зависне од повишених нивоа MYC да би продужиле преживљавање пацијената са TNBC (Einstein et al., 2021), што сугерише да би могао бити потенцијална терапијска мета за лекове који могу да превазиђу TNBC.
Протеини цинкових прстију (ZNF) чине приближно 1% укупног људског генома. Студије су показале да ZNF може да регулише пролиферацију ћелија код различитих врста рака, као што су рак јетре, рак дојке и колоректални карцином (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Библиотеке генерисане CRISPR нокаутом коришћене су за скрининг различитих гена супресора тумора (TSG) у ћелијама рака дојке (Shalem et al., 2014). Од тада, транскриптомска студија ћелија рака дојке са CRISPR/Cas9 ZNF319-делетираном геном показала је да је ZNF319 ген супресора тумора који смањује пролиферацију рака дојке и стога је укључен у различите потенцијалне механизме сигнализације и друге биолошке функције (Wang L. et al., 2022).
Фероптоза је врста програмиране ћелијске смрти која зависи од присуства гвожђа. Познато је да на развој фероптозе утиче присуство липидних пероксида. Поред тога, објављено је да PKCβII показује рану липидну пероксидацију, а повећана липидна пероксидација је повезана са фероптозом. Скрининг библиотеке инхибитора киназе посредованих CRISPR/Cas9 открио је да је PKCβII укључен у процес липидне пероксидације, што је критично за фероптозу у ћелијама MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Стога, ово сугерише да нокаут PKCβII помоћу CRISPR/Cas9 може бити потенцијална мета гена супресора тумора за лечење болести повезаних са фероптозом (Zhang et al., 2022).
Верује се да је резистенција на лекове одговорна за приближно 90% смртних случајева код пацијената оболелих од рака и један је од главних изазова у лечењу рака (Bukowski et al., 2020). Резултати указују да је довољан број гена повезаних са излучивањем лекова, поправком ДНК, апоптозом и различитим путевима ћелијске сигнализације повезан са резистенцијом на лекове (Haider et al., 2020). Међу њима, неколико гена је циљано CRISPR/Cas9 алатима и показали су обећавајуће резултате у смањењу резистенције на лекове и повећању ефикасности третмана против рака (Vaghari-Tabari et al., 2022). Поред тога, високопропусне библиотеке за скрининг нокаута гена CRISPR/Cas9 имплициране су у модификовању функције потенцијалних циљева гена резистенције на лекове (Shalem et al., 2015). Да би се идентификовали гени отпорности на паклитаксел, коришћено је секвенцирање РНК у комбинацији са скринингом sgRNA библиотеке на нивоу целог генома како би се идентификовало осам кандидатских гена, укључујући хистон деацетилазу 9 (HDAC9), који су повезани са резистенцијом на лекове код пацијената са рекурентним TNBC (B et al., 2020). У другој студији, повећана експресија дисерина/треонина и тирозин протеин киназе (DSTYK) је примећена током преживљавања пацијената са TNBC лечених лековима против рака. Штавише, CRISPR/Cas9-посредовано смањење експресије DSTYK значајно је побољшало апоптозу ћелија рака отпорних на лекове in vitro (ћелије SUM102PT и ћелије MDA-MB-468) и in vivo модел TNBC (Ogbu et al., 2021).
Иако TNBC има абнормалну активацију MAPK пута, клинички ефекат терапија усмерених на MEK је слаб. Скрининг геномске библиотеке CRISPR/Cas9 показао је да инхибиција PSMG2 (шаперон 2 склапања протеома) сензибилизује TNBC ћелије BT549 и MB468 на MEK инхибитор AZD6244. Обарање PSMG2 помоћу CRISPR/Cas9 изменило је нормалну функцију протеазома, што је довело до аутофагијом посредованог растављања PDPK1, чиме се додатно побољшавају туморске ћелије у TNBC мишјим моделима индукованим AZD6244 (MEK инхибитор) и MG132 (протеазомен инхибитор). Стога, инхибитори протеазома и MAP киназе (MEK) могу се примењивати синергистички како би се смањила пролиферација туморских ћелија (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 је такође коришћен за скрининг губитка функције гена што доводи до резистенције на TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al. су објаснили механизам резистенције на лекове ћелија рака третираних са JQ1, BET бромодоменским инхибитором (BBDI), код TNBC. Користећи CRISPR/Cas9, открили су да брисање гена rb1 доводи до тога да TNBC постане отпоран на лек против рака JQ1. Стога је функција rb1 важна у одговору на JQ1 лекове код TNBC. Такође су известили да је паклитаксел инхибитор CDK4/6 киназе/микротубула, и да његова комбинација са BBDI као што је JQ1 може пружити обећавајуће терапеутске одговоре на TNBC отпоран на лекове (Ge et al., 2020).
Пријављено је да је транскрипциони пејзаж дуге некодирајуће РНК (lncRNA) одговоран за отпорност на неоадјувантну терапију код TNBC. Ова студија показује да је пет различитих MALAT1 lncRNA транскрипата високо експресовано код TNBC. Поред тога, CRISPR/Cas9-посредована делеција MALAT1 повећала је осетљивост TNBC BT-549 ћелија на паклитаксел и доксорубицин, што указује на потенцијалну улогу отпорности на MALAT1 код TNBC (Shaath et al., 2021).
Мутације у BRCA1 (BRCA1m) су хетерогене и стога их је тешко открити. Циљање на PARP1 (поли(АДП-рибоза) полимеразу), синтетичког смртоносног партнера BRCA1, може повећати хемосензитивност лекова код TNBC. Коришћењем CRISPR/Cas9, делеција PARP1 повећала је осетљивост лекова против рака као што су доксорубицин, гемцитабин и доцетаксел на ћелије TNBC мутанта mBRCA1, што сугерише да је PARP1 такође укључен у резистенцију на лекове код TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Познато је да мутације у генима тумор супресора BRCA1 или BRCA2 повећавају вероватноћу развоја рака дојке код људи. Лечење ових пацијената захтева употребу PARP инхибитора. Поред тога, показано је да нокаут фактора спасавања нуклеотида DNPH1 коришћењем CRISPR/Cas9 може уклонити токсични нуклеотид 5-хидроксиметилдеоксиуридин (hmdU) монофосфат, чиме се побољшава одговор ћелија са недостатком BRCA на осетљивост на PARP инхибиторе (Fugger). et al., 2021). Стога, CRISPR/Cas9 и PARP1 инхибитори могу постати важна стратегија лечења TNBC.
Ген за пенетрантни гликопротеин (P-gp) је ген отпорности на више лекова који је генерално појачано регулисан код приближно 41% свих случајева необичног рака дојке (TNBC) (Sun et al., 2020). Ефлукс лекова изазван P-gp-ом идентификован је као кључни регулатор отпорности на лекове код рака дојке. Инхибитори P-gp су показали повећану осетљивост на лекове против рака код рака дојке (Famta et al., 2021). Стога, аблација или супресија P-gp и инхибитора P-gp посредована CRISPR/Cas9 могу бити веома важне методе за превазилажење отпорности на лекове код TNBC.
Познато је да АТП-везујући касетни транспортер G2 (ABCG2) изазива резистенцију на лекове код TNBC (Palasuberniam et al., 2015), иако тренутно нема извештаја о вези између CRISPR/Cas9 и утишавања ABCG2 и инактивације гена туморског супресора. PTEN може појачати активацију ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Стога, коришћење CRISP/Ca9 за уклањање ABCG2 и његово комбиновање са инхибитором ABCG2 може бити погодан третман за превазилажење резистенције на лекове код TNBC. Табела 2 помиње CRISPR/Cas9 који циља све гене резистенције.
Табела 2. CRISPR/Cas9 циља различите гене отпорности на TNBC како би сензибилизовао ћелије на лекове против рака.
CRISPR/Cas9 библиотеке су потенцијални алати за скрининг генских мутација повезаних са патогенезом рака (Chan et al., 2022). Ова метода скрининга укључује четири корака као што су (а) изградња библиотеке, (б) лентивирусна трансдукција, (ц) фенотипски скрининг и (д) анализа циљних гена. Иако TNBC има абнормалну активацију MAPK пута, клиничка прогноза MEK циљане терапије за пацијенте са TNBC који носе мутације у тумор супресорским генима као што су PTEN, RB1 и TP53 је веома лоша.
Поред тога, скрининг гена нокаутом коришћењем CRISPR/Cas9 тестирао је најпотентнији и селективнији молекул, дехидрокатрол, који је обилан у екстрактима гватемалског цвећа и листова, како би се разумео ефекат дехидрокатрола на MDA-MB-231. Механизми селективне ћелијске цитотоксичности. Карактеристике мезенхималне стабљике TNBC подтипова. Овај скрининг заснован на CRISPR/Cas9 такође је открио да је HSD17B11, ген који кодира 17β-хидроксистероид дехидрогеназу тип 11, високо експресован у MDA-MB-231 ћелијама и резултира дехидрофалкаринолом специфичним за MDA-MB-231 ћелије (Grant et. al., 2020). Дакле, ово сугерише да геномски скрининг CRISPR/Cas9 има велики потенцијал у идентификацији механизама који леже у основи антиканцерогених својстава потенцијалних природних једињења.
Поред тога, осетљивост TNBC на рак је проучавана коришћењем непристрасног in vivo CRISPR/Cas9 скрининга на нивоу целог генома, који је показао везу између онкогених и тумор супресорских путева. Пријављено је да кључне компоненте mTOR и Hippo путева играју важну улогу у регулацији тумора код TNBC. Поред тога, студије су показале да фармаколошка инхибиција mTORC1/2 и YAP онкопротеина ефикасно инхибира патогеност TNBC коришћењем in vitro модела синергије лек-матрикс и in vivo ксенографтова изведених од пацијената. Штавише, инхибиција mTORC1/2 посредована Torin-1 појачава макропиноцитозу, док инхибиција YAP-а индукована вертепорфином доводи до ћелијске смрти TNBC. Узети заједно, ови резултати истичу моћ и робусност in vivo CRISPR скрининга на нивоу целог генома за идентификацију нових и ефикасних третмана за TNBC (Dai et al., 2021).
Дисрегулација имуног система је важан фактор у туморогенези. Ћелије рака избегавају имуно клиренс заобилазећи одбрамбене механизме, укључујући ометање активности имуних ћелија у микроокружењу тумора и угрожавање имуног система. Стога, развој побољшаног имуног система може бити кључни приступ борби против тумора. Употреба генске модификације засноване на CRISPR/Cas9 решава неколико проблема везаних за имунолошку дисфункцију из различитих перспектива. CRISPR/Cas9 је коришћен за побољшање антитуморског имунитета против рака дојке кроз следеће путеве (Слика 3).
Слика 3. CRISPR/Cas9 имунотерапија циља TNBC ћелије. Губитак CDK5 и обарање PDL1 и CD155 јачају имуни систем. Слично томе, губитак A2AR и обарање TAA као што су HER2, муцин 1 и TEM8 повећали су ефикасност CAR-T ћелија у убијању ћелија рака. CRISPR/Cas9-вођен скрининг Т ћелија показао је да поремећај p38 киназе појачава антитуморску активност Т ћелија. Т ћелије модификоване помоћу CRISPR/Cas9 повећавају експресију TCR (T ћелијског рецептора), што резултира тиме да Т ћелије имају антитуморску активност.
Циљ имунотерапије је стимулисање имуног система да напада ћелије рака. Прекомерна експресија протеина имуних контролних тачака обично спречава аутоимуне реакције, али може помоћи карциномима да их избегну (Topalian et al., 2015). Ови протеини спречавају имуне реакције везивањем за рецепторе на површини имуних ћелија. Вишеструки протеини контролних тачака (као што су CD155 и PD-L1) циљају PD-1 рецептор на имуним ћелијама и експресују се код рака дојке, посебно TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Нокаутирање PD-L1 или његовог рецептора помоћу CRISPR/Cas9 може стимулисати имуни систем да напада TNBC туморе (Yahata et al., 2019). Поред тога, показано је да смањење експресије PD-L1 путем CRISPR/Cas9-посредоване делеције CDK5 инхибира раст тумора in vitro и in vivo (Deng et al., 2020). Инхибиција раста у ин витро и ин виво моделима рака дојке сугерише да смањење CD155 посредовано shRNA може имати терапеутски ефекат на рак дојке (Gao et al., 2018).
CAR Т ћелије експресују CAR ћелије које препознају антигене повезане са тумором (TAA) и могу користити обарање протеина контролних тачака да би појачале своју активност (Li C. et al., 2020). Постоје различите потенцијалне мете за CAR Т ћелијску терапију код рака дојке, укључујући неколико TAA као што су HER2, mucin1 и TEM8 (Bajgain et al., 2018). Постоје докази да су CAR Т ћелије које циљају мезотелин (прекомерно експресован у TNBC BT-459 ћелијама) ефикасније против рака када је PD-1 обрађен помоћу CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Међутим, изоловање Т ћелија од пацијената, а затим њихово ex vivo уређивање је процес који захтева много рада и времена. Иако универзалне Т ћелије могу смањити захтеве за изолацијом, донорске Т ћелије које експресују хумани леукоцитарни антиген (HLA) класе I и Т ћелијски рецептор (TCR) треба уклонити како би се спречиле абнормалности реакције калем-против-домаћина (Ren et al., 2017). Користећи CRISPR/Cas9, HDR може истовремено елиминисати TCR и HLA и нокаутирати ген који кодира CAR. Студије су показале да се CRISPR/Cas9 може користити за увођење анти-CD19 CAR у TCR локус, чиме се ефикасно производе CAR без исцрпљивања Т ћелија (Dimitri et al., 2022). Развијене су мултиплекс технологије за генерисање алогених CAR Т ћелија истовременим елиминисањем TCR, бета-2-микроглобулина (B2M), HLA-I подјединице и других протеина као што су PD-1 и CTLA-4, који могу имати већа антиканцерогена својства против TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Коришћење CRISPR/Cas9 могло би побољшати ефикасност CAR-T ћелија. Познато је да аденозин има имуносупресивна својства и може смањити антиканцерогени имунитет блокирањем функције Т ћелија и активирањем аденозинских A2A рецептора (A2AR) (Vigano et al., 2019). Утишавање A2AR помоћу CRISPR/Cas9 значајно је побољшало ефикасност CAR-T ћелија in vivo (Giuffrida et al., 2021). Познато је да T ћелије показују различите фенотипске карактеристике као што су ћелијска експанзија, диференцијација, оксидативни стрес и геномски стрес. Скрининг T ћелија заснован на CRISPR/Cas9 открио је поремећај 25 различитих киназа T ћелијских рецептора. Међу њима, показано је да делеција p38 киназе побољшава антитуморску активност T ћелија, што указује да је p38 киназа кључни регулатор регулације CAR-T ћелија (Gurusamy et al., 2020).
Т ћелије могу бити генетски модификоване коришћењем CRISPR/Cas9 да би се произвели високо експресовани TCR-ови. Пренос генетски модификованих Т ћелија пацијентима показао је јачу антиканцерогену активност него ендогене Т ћелије. Стога, ендогени TCR-ови могу да се такмиче са генетски измењеним TCR-има код пацијената, што може утицати на потенцијал имунотерапије рака. Да би се превазишао овај проблем, коришћење CRISPR/Cas9 за уклањање ендогеног TCR-β у ћелијама примаоцима и накнадни пренос TCR-β Т ћелија пацијентима оболелим од рака може показати боље имунолошке одговоре против рака без потребе за ендогеном сексуалном конкуренцијом TCR (Fan et al. 2018). Дакле, са изузетком CRISPR-модификованих Т ћелија, TCR-ови су хиљаду пута осетљивији на туморске антигене него нормалне TCR-трансдуковане Т ћелије. Поред тога, код различитих леукемија, измењене Т ћелије генерисане помоћу γδ TCR+ CRISPR-а показују већу експресију CD4+ и CD8+ Т ћелија него стандардни TCR трансфер (Legut et al., 2018). Стога, модификоване Т ћелије генерисане помоћу CRISPR/Cas9 могу бити ефикасна метода имунотерапије за превазилажење TNBC-а.
Интегрини су молекули ћелијске адхезије који су присутни у ћелијским трансмембранама и подстичу везивање ћелија за екстрацелуларни матрикс (ECM) (Hamidi и Ivaska, 2018). Дисрегулација интегрина је повезана са развојем и миграцијом рака променом екстрацелуларног матрикса, што доводи до преживљавања ћелија рака у циркулацији (Hamidi и Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-посредовано смањење експресије интегрина успорава прогресију тумора, метастазе и колонизацију код TNBC. Пријављено је да смањење експресије интегрина a5 (ITGA5) смањује миграцију и прогресију ћелија код других карцинома као што је рак плућа (Ju et al., 2017), што сугерише да интегрин a5 такође може бити кључни фактор у патогенези TNBC.
Генерисање нокаут мишева коришћењем традиционалних метода ембрионалних матичних ћелија (ЕС) је процес који захтева много рада, времена и је неефикасан. Потребни су месеци и године да се ЕС ћелије циљају путем хомологне рекомбинације, узгајају химерни мишеви, а затим укрсте са хетерозиготним мишевима да би се произвело хомозиготно потомство. За стварање мишева са вишеструким генетским мутацијама потребно је сложено укрштање. Међутим, многи проблеми су се појавили када се користе мишеви генерисани аблацијом ЕС ћелија коришћењем CRISPR/Cas9 или микроињекцијом CRISPR/Cas9 компоненти у оплођена јајна ћелија једне ћелије. На пример, уношење промена се често дешава на биалелним локусима и није генски специфично. Недавно је објављено да ЕС ћелије које користе CRISPR/Cas9 технологију могу истовремено да убаце биалелне мутације у до 5 гена (Nishizono et al., 2021). У ту сврху, Cas9 mRNA и пет генски специфичних gRNA су истовремено трансфектоване у ЕС ћелије. Ово истиче обећање и ефикасност ове процедуре, иако су ове мутације можда пренете када су оснивачке линије укрштане да би се произвели петоструки нокаут мишеви. Студија такође извештава о изненађујућем открићу: ЕС ћелије више нису потребне за стварање генетски модификованих мишева. Уместо тога, да би се уклонили специфични генски производи, Cas9 mRNA и gRNA су убризгане у ембрионе једноћелијске фазе. Као резултат тога, створене су нокаут оснивачке линије које се теоретски могу користити за проучавање последица делеције гена код мишева (Qin et al., 2016). Дакле, CRISPR/Cas9 омогућава стварање трансгених мишева за лечење TNBC по нижој цени него традиционални генетски инжењеринг. Користећи CRISPR/Cas систем, развијен је нови модел нокаут миша који може успешно увести тачкасте мутације у једном или више ендогених гена код TNBC. На основу овог концепта, животињски модели TNBC такође се могу развити коришћењем CRISPR/Cas9-посредоване делеције BRCA1 и p53, што резултира губитком поправке HR, геномском нестабилношћу и мутантним фенотипима (Annunziato et al., 2020).
Тренутно се користе различите методе као што су мамографија, магнетна резонанца (МРИ) и ултразвук за дијагностиковање TNBC. Међутим, ове методе имају нека ограничења. Мамографија се користи за дијагностиковање локалног ткива дојке, а не метастаза, где су ћелије рака мигрирале у друге органе. Ултрасонографија није поуздана метода за дијагностиковање TNBC (Chen and Lee-Felker, 2023). МРИ има већу осетљивост од ултразвука и мамографије, али је њена дијагностичка тачност ограничена (Sha and Chen, 2022). Биопсија ткива је инвазиван начин за идентификацију ћелија рака. Међутим, у неким случајевима, биопсија може пропустити канцерогено ткиво ако игла одлута од подручја интересовања. Поред тога, веома је скупа и може бити трауматична за пацијента. TNBC је хетероген тип рака, тако да биопсија можда неће пружити довољно информација о врсти рака. Стога је хитно потребна нова дијагностички поуздана метода за откривање TNBC. CRISPR/Cas9 може послужити као веома осетљива и минимално инвазивна алтернатива за дијагнозу рака дојке. У том циљу, стратегије засноване на CRISPR/Cas9 могу се користити за побољшање PCR метода за дијагнозу TNBC. Прво, Cas9 и cpf1 протеини CRISPR система се користе за уклањање неспецифичне ДНК, а затим ова два протеина (Cas9 и cpf1) могу препознати PAM секвенцу пре везивања за циљну ДНК (Deepak Singh et al., 2021). Дакле, PCR може идентификовати мутације повезане са развојем рака. Неколико студија је усвојило ову CRISPR-базирану стратегију за откривање различитих мутација код различитих карцинома (Safari et al., 2019). Дакле, CRISPR-базиране методе могу смањити зависност дијагнозе TNBC од инвазивних метода као што је имунохистохемија заснована на биопсији.
Генотипске промене у регулацији хормонских рецептора су такође демонстриране код TNBC (Chen and Russo, 2009). PCR стратегије засноване на CRISPR/Cas9 које користе микронизове за дијагностику на месту неге могу ефикасно пратити ове мутације (Hajian et al., 2019). Такође би могле да обезбеде здравственим радницима релевантне информације о специфичним мутацијама код пацијената са TNBC, што би могло помоћи у побољшању њиховог тока лечења. Међутим, ова комбинована техника има ограничења. Стога су потребни опсежни истраживачки напори пре него што се ова CRISPR/Cas-PCR метода може користити у здравству за дијагнозу TNBC (Yang et al., 2019).
Време објаве: 14. октобар 2024.