Диференцијална дијагноза плућних чворова идентификованих компјутеризованом томографијом (ЦТ) остаје изазов у клиничкој пракси.Овде карактеришемо глобални метаболом од 480 узорака серума, укључујући здраве контроле, бенигне чворове плућа и аденокарцином плућа И стадијума.Аденокарциноми показују јединствене метаболомске профиле, док бенигни нодули и здрави појединци имају велику сличност у метаболомским профилима.У групи која је открила (н = 306), идентификован је скуп од 27 метаболита да би се разликовали бенигни и малигни чворови.АУЦ дискриминантног модела у групама за интерну валидацију (н = 104) и екстерну валидацију (н = 111) био је 0,915 и 0,945, респективно.Анализа пута је открила повећане гликолитичке метаболите повезане са смањеним триптофаном у серуму аденокарцинома плућа у поређењу са бенигним чворовима и здравим контролама, и сугерисала да унос триптофана промовише гликолизу у ћелијама рака плућа.Наша студија наглашава вредност биомаркера метаболита у серуму у процени ризика од плућних нодула откривених ЦТ.
Рана дијагноза је кључна за побољшање стопе преживљавања пацијената са раком.Резултати америчког Националног испитивања карцинома плућа (НЛСТ) и европске НЕЛСОН студије су показали да скрининг са ниском дозом компјутеризоване томографије (ЛДЦТ) може значајно смањити смртност од рака плућа у групама високог ризика1,2,3.Од раширене употребе ЛДЦТ-а за скрининг карцинома плућа, учесталост случајних радиографских налаза асимптоматских плућних чворова наставља да расте 4 .Плућни чворови се дефинишу као фокалне опацитете до 3 цм у пречнику 5 .Суочавамо се са потешкоћама у процени вероватноће малигнитета и суочавању са великим бројем плућних нодула откривених случајно на ЛДЦТ.Ограничења ЦТ-а могу довести до честих контролних прегледа и лажно позитивних резултата, што доводи до непотребне интервенције и прекомерног лечења6.Због тога постоји потреба да се развију поуздани и корисни биомаркери за исправну идентификацију карцинома плућа у раним стадијумима и диференцијацију већине бенигних нодула при почетном откривању 7 .
Свеобухватна молекуларна анализа крви (серум, плазма, мононуклеарне ћелије периферне крви), укључујући геномику, протеомику или ДНК метилацију8,9,10, довела је до све већег интересовања за откривање дијагностичких биомаркера за рак плућа.У међувремену, метаболомички приступи мере ћелијске крајње производе на које утичу ендогена и егзогена дејства и стога се примењују за предвиђање почетка и исхода болести.Течна хроматографија-тандем масена спектрометрија (ЛЦ-МС) је широко коришћена метода за метаболомичке студије због своје високе осетљивости и великог динамичког опсега, који може покрити метаболите са различитим физичко-хемијским својствима11,12,13.Иако је глобална метаболомска анализа плазме/серума коришћена за идентификацију биомаркера повезаних са дијагнозом карцинома плућа14,15,16,17 и ефикасношћу лечења,18 класификатори серумских метаболита за разликовање бенигних и малигних чворова плућа остају да се доста проучавају.-масовно истраживање.
Аденокарцином и карцином сквамозних ћелија су два главна подтипа карцинома не-малих ћелија плућа (НСЦЛЦ).Различити ЦТ скрининг тестови показују да је аденокарцином најчешћи хистолошки тип рака плућа1,19,20,21.У овој студији, користили смо ултра-перформансну течну хроматографију-масену спектрометрију високе резолуције (УПЛЦ-ХРМС) да бисмо извршили анализу метаболомике на укупно 695 узорака серума, укључујући здраве контроле, бенигне плућне чворове и ЦТ-откривене ≤3 цм.Скрининг за стадијум И аденокарцинома плућа.Идентификовали смо панел серумских метаболита који разликују аденокарцином плућа од бенигних чворова и здравих контрола.Анализа обогаћивања путева открила је да су абнормални метаболизам триптофана и глукозе уобичајене промене у аденокарциному плућа у поређењу са бенигним чворовима и здравим контролама.Коначно, успоставили смо и потврдили серумски метаболички класификатор са високом специфичношћу и осетљивошћу да бисмо разликовали малигне и бенигне плућне нодуле откривене ЛДЦТ, што може помоћи у раној диференцијалној дијагнози и процени ризика.
У тренутној студији, узорци серума који одговарају полу и узрасту су ретроспективно прикупљени од 174 здраве контроле, 292 пацијента са бенигним плућним нодулима и 229 пацијената са стадијумом И плућног аденокарцинома.Демографске карактеристике 695 испитаника приказане су у Додатној табели 1.
Као што је приказано на слици 1а, укупно 480 узорака серума, укључујући 174 здраве контроле (ХЦ), 170 бенигних чворова (БН) и 136 узорака аденокарцинома плућа И фазе (ЛА), прикупљено је у Центру за рак Универзитета Сун Иат-сен.Кохорта открића за нециљано метаболомско профилисање коришћењем течне хроматографије ултра-перформансе-масене спектрометрије високе резолуције (УПЛЦ-ХРМС).Као што је приказано на додатној слици 1, идентификовани су диференцијални метаболити између ЛА и ХЦ, ЛА и БН да би се успоставио модел класификације и даље истражила анализа диференцијалног пута.104 узорка које је сакупио Центар за рак Универзитета Сун Јат-сен и 111 узорака које су прикупиле две друге болнице подвргнути су интерној и екстерној валидацији, респективно.
а Студијска популација у кохорти открића која је подвргнута глобалној серумској метаболомичкој анализи коришћењем течне хроматографије ултра-перформансе – масене спектрометрије високе резолуције (УПЛЦ-ХРМС).б Парцијална дискриминантна анализа најмањих квадрата (ПЛС-ДА) укупног метаболома 480 узорака серума из испитиване кохорте, укључујући здраве контроле (ХЦ, н = 174), бенигне чворове (БН, н = 170) и аденокарцином плућа И стадијума (Лос Анђелес, н = 136).+ЕСИ, позитивни електроспреј режим јонизације, -ЕСИ, негативан режим јонизације електроспрејом.ц–е Метаболити са значајно различитом заступљеношћу у две дате групе (двострани Вилцокон сигнед ранг тест, лажна стопа откривања прилагођена п вредност, ФДР <0,05) приказани су црвеном (промена пута > 1,2) и плавом (промена пута < 0,83) .) приказано на графици вулкана.ф Хијерархијска кластерска топлотна мапа која показује значајне разлике у броју означених метаболита између ЛА и БН.Изворни подаци се пружају у облику датотека изворних података.
Укупни серумски метаболом од 174 ХЦ, 170 БН и 136 ЛА у групи открића је анализиран коришћењем УПЛЦ-ХРМС анализе.Прво показујемо да се узорци контроле квалитета (КЦ) чврсто групишу у центру ненадзираног модела анализе главних компоненти (ПЦА), потврђујући стабилност учинка тренутне студије (додатна слика 2).
Као што је приказано у анализи делимичне дискриминације најмањих квадрата (ПЛС-ДА) на слици 1б, открили смо да постоје јасне разлике између ЛА и БН, ЛА и ХЦ у позитивном (+ЕСИ) и негативном (−ЕСИ) режиму јонизације електроспрејом .изолован.Међутим, нису нађене значајне разлике између БН и ХЦ у +ЕСИ и -ЕСИ условима.
Пронашли смо 382 диференцијалне карактеристике између ЛА и ХЦ, 231 диференцијалне карактеристике између ЛА и БН и 95 диференцијалних карактеристика између БН и ХЦ (Вилцокон сигнед ранк тест, ФДР <0,05 и вишеструке промене >1,2 или <0,83) (Слика .1ц-е )..Врхови су додатно означени (додатни подаци 3) у бази података (мзЦлоуд/ХМДБ/Цхемспидер библиотека) помоћу м/з вредности, времена задржавања и претраге масеног спектра фрагментације (детаљи описани у одељку Методе) 22 .Коначно, 33 и 38 означених метаболита са значајним разликама у обиљу идентификовани су за ЛА у односу на БН (слика 1ф и додатна табела 2) и ЛА у односу на ХЦ (додатна слика 3 и додатна табела 2), респективно.Насупрот томе, само 3 метаболита са значајним разликама у обиљу идентификована су у БН и ХЦ (додатна табела 2), у складу са преклапањем између БН и ХЦ у ПЛС-ДА.Ови диференцијални метаболити покривају широк спектар биохемикалија (допунска слика 4).Узети заједно, ови резултати показују значајне промене у серумском метаболому које одражавају малигну трансформацију рака плућа у раној фази у поређењу са бенигним плућним чворовима или здравим субјектима.У међувремену, сличност серумског метаболома БН и ХЦ сугерише да бенигни плућни нодули могу делити многе биолошке карактеристике са здравим особама.С обзиром на то да су мутације гена рецептора епидермалног фактора раста (ЕГФР) уобичајене у подтипу 23 аденокарцинома плућа, покушали смо да утврдимо утицај мутација покретача на серумски метаболом.Затим смо анализирали укупан метаболомски профил 72 случаја са ЕГФР статусом у групи са аденокарциномом плућа.Занимљиво је да смо пронашли упоредиве профиле између пацијената са мутантима ЕГФР (н = 41) и пацијената дивљег типа ЕГФР (н = 31) у ПЦА анализи (додатна слика 5а).Међутим, идентификовали смо 7 метаболита чија је бројност значајно измењена код пацијената са мутацијом ЕГФР у поређењу са пацијентима са дивљим типом ЕГФР (т тест, п < 0,05 и промена пута > 1,2 или < 0,83) (додатна слика 5б).Већина ових метаболита (5 од 7) су ацилкарнитини, који играју важну улогу у путевима оксидације масних киселина.
Као што је илустровано у току рада приказаном на слици 2 а, биомаркери за класификацију нодула су добијени коришћењем оператора најмањег апсолутног скупљања и селекције на основу 33 диференцијална метаболита идентификована у ЛА (н = 136) и БН (н = 170).Најбоља комбинација варијабли (ЛАССО) – бинарни логистички регресијски модел.За тестирање поузданости модела коришћена је десетострука унакрсна валидација.Избор варијабли и регуларизација параметара се прилагођавају казном максимизације вероватноће са параметром λ24.Глобална метаболомичка анализа је даље спроведена независно у групама за интерну валидацију (н = 104) и екстерну валидацију (н = 111) да би се тестирала ефикасност класификације дискриминантног модела.Као резултат тога, 27 метаболита у скупу открића идентификовано је као најбољи дискриминантни модел са највећом средњом вредношћу АУЦ (слика 2б), међу којима је 9 имало повећану активност и 18 смањену активност у ЛА у поређењу са БН (слика 2ц).
Ток рада за прављење класификатора плућних нодула, укључујући одабир најбољег панела серумских метаболита у сету за откривање користећи бинарни логистички регресиони модел путем десетоструке унакрсне валидације и процену предиктивних перформанси у интерним и екстерним сетовима за валидацију.б Статистика унакрсне валидације ЛАССО регресионог модела за избор метаболичких биомаркера.Горе наведени бројеви представљају просечан број биомаркера изабраних на датом λ.Црвена тачкаста линија представља просечну вредност АУЦ на одговарајућој ламбди.Сиве траке грешке представљају минималне и максималне вредности АУЦ.Испрекидана линија означава најбољи модел са 27 одабраних биомаркера.АУЦ, површина испод криве радне карактеристике пријемника (РОЦ).ц Преклопне промене 27 одабраних метаболита у ЛА групи у поређењу са БН групом у групи која је открила.Црвена колона – активација.Плава колона је пад.д–ф Криве радне карактеристике пријемника (РОЦ) које показују снагу дискриминантног модела заснованог на 27 комбинација метаболита у сетовима за откривање, интерну и екстерну валидацију.Изворни подаци се пружају у облику датотека изворних података.
Модел предвиђања је креиран на основу пондерисаних коефицијената регресије ових 27 метаболита (додатна табела 3).РОЦ анализа заснована на ових 27 метаболита дала је вредност површине испод криве (АУЦ) од 0,933, осетљивост групе открића била је 0,868, а специфичност 0,859 (слика 2д).У међувремену, међу 38 означених диференцијалних метаболита између ЛА и ХЦ, скуп од 16 метаболита је постигао АУЦ од 0,902 са осетљивошћу од 0,801 и специфичношћу од 0,856 у разликовању ЛА од ХЦ (додатна слика 6а-ц).Такође су упоређене вредности АУЦ засноване на различитим праговима промене пута за диференцијалне метаболите.Открили смо да се модел класификације најбоље показао у разликовању између ЛА и БН (ХЦ) када је ниво промене набора постављен на 1,2 у односу на 1,5 или 2,0 (додатна слика 7а, б).Модел класификације, заснован на 27 група метаболита, даље је потврђен у интерним и екстерним кохортама.АУЦ је био 0,915 (осетљивост 0,867, специфичност 0,811) за интерну валидацију и 0,945 (осетљивост 0,810, специфичност 0,979) за екстерну валидацију (Слика 2е, ф).Да би се проценила међулабораторијска ефикасност, 40 узорака из екстерне кохорте је анализирано у спољној лабораторији као што је описано у одељку Методе.Тачност класификације је достигла АУЦ од 0,925 (додатна слика 8).Пошто је карцином сквамозних ћелија плућа (ЛУСЦ) други најчешћи подтип неситноћелијског карцинома плућа (НСЦЛЦ) након аденокарцинома плућа (ЛУАД), такође смо тестирали потврђену потенцијалну корисност метаболичких профила.БН и 16 случајева ЛУСЦ.АУЦ дискриминације између ЛУСЦ и БН био је 0,776 (додатна слика 9), што указује на лошију способност у поређењу са дискриминацијом између ЛУАД и БН.
Студије су показале да је величина нодула на ЦТ снимцима у позитивној корелацији са вероватноћом малигнитета и остаје главна детерминанта лечења нодула25,26,27.Анализа података из велике групе НЕЛСОН скрининг студије показала је да је ризик од малигнитета код субјеката са чворовима <5 мм чак сличан оном код испитаника без чворова 28 .Према томе, минимална величина која захтева редовно ЦТ праћење је 5 мм, како препоручује Британско торакално друштво (БТС), и 6 мм, како препоручује Флеисцхнер Социети 29 .Међутим, чворови већи од 6 мм и без очигледних бенигних карактеристика, који се називају неодређени плућни нодули (ИПН), остају главни изазов у процени и лечењу у клиничкој пракси30,31.Затим смо испитали да ли је величина нодула утицала на метаболомске потписе користећи обједињене узорке из кохорти открића и интерне валидације.Фокусирајући се на 27 валидираних биомаркера, прво смо упоредили ПЦА профиле метаболома ХЦ и БН испод 6 мм.Открили смо да се већина тачака података за ХЦ и БН преклапа, показујући да су нивои метаболита у серуму слични у обе групе (слика 3а).Мапе карактеристика у различитим распонима величина остале су очуване у БН и ЛА (слика 3б, ц), док је уочено раздвајање између малигних и бенигних чворова у опсегу од 6–20 мм (слика 3д).Ова кохорта је имала АУЦ од 0,927, специфичност од 0,868 и осетљивост од 0,820 за предвиђање малигнитета чворова величине 6 до 20 мм (Слика 3е, ф).Наши резултати показују да класификатор може да обухвати метаболичке промене изазване раном малигном трансформацијом, без обзира на величину нодула.
ад Поређење профила ПЦА између наведених група на основу метаболичког класификатора од 27 метаболита.ЦЦ и БН < 6 мм.б БН < 6 мм наспрам БН 6–20 мм.у ЛА 6–20 мм наспрам ЛА 20–30 мм.г БН 6–20 мм и ЛА 6–20 мм.ГЦ, н = 174;БН < 6 мм, н = 153;БН 6–20 мм, н = 91;ЛА 6–20 мм, н = 89;ЛА 20–30 мм, н = 77. е Крива радне карактеристике пријемника (РОЦ) која показује перформансе дискриминантног модела за нодуле 6–20 мм.ф Вредности вероватноће су израчунате на основу модела логистичке регресије за чворове величине 6–20 мм.Сива тачкаста линија представља оптималну граничну вредност (0,455).Горе наведени бројеви представљају проценат случајева предвиђених за Лос Анђелес.Користите двострани Студентов т тест.ПЦА, анализа главних компоненти.АУЦ површина испод криве.Изворни подаци се пружају у облику датотека изворних података.
Четири узорка (старости 44–61 година) са сличним величинама плућних нодула (7–9 мм) су даље одабрана да би се илустровао учинак предложеног модела предвиђања малигнитета (Слика 4а, б).На почетном скринингу, Случај 1 је представљен као чврсти чвор са калцификацијама, карактеристика повезана са бенигношћу, док је Случај 2 представљен као неодређени делимично чврст чвор без очигледних бенигних карактеристика.Три рунде накнадних ЦТ скенирања су показале да су ови случајеви остали стабилни током периода од 4 године и стога се сматрају бенигним нодулима (Слика 4а).У поређењу са клиничком проценом серијских ЦТ скенирања, анализа метаболита серума појединачних ињекција са тренутним моделом класификатора је брзо и тачно идентификовала ове бенигне чворове на основу вероватноћних ограничења (Табела 1).На слици 4б у случају 3 приказан је чвор са знацима плеуралне ретракције, што је најчешће удружено са малигнитетом32.Случај 4 представљен је као неодређени делимично чврст чвор без доказа о бенигном узроку.Сви ови случајеви су предвиђени као малигни према моделу класификатора (Табела 1).Процена аденокарцинома плућа је показана хистопатолошким прегледом после операције ресекције плућа (слика 4б).За скуп екстерне валидације, метаболички класификатор је тачно предвидео два случаја неодређених плућних нодула већих од 6 мм (додатна слика 10).
ЦТ слике аксијалног прозора плућа два случаја бенигних нодула.У случају 1, ЦТ скенирање после 4 године показало је стабилан чврсти нодул величине 7 мм са калцификацијама у десном доњем режњу.У случају 2, ЦТ скенирање након 5 година открило је стабилан, делимично чврст чвор пречника 7 мм у десном горњем режњу.б Аксијални прозор ЦТ слике плућа и одговарајуће патолошке студије два случаја аденокарцинома стадијума И пре ресекције плућа.У случају 3 откривен је чвор пречника 8 мм у десном горњем режњу са плеуралном ретракцијом.Случај 4 открио је делимично чврст чворић од брушеног стакла величине 9 мм у левом горњем режњу.Бојење хематоксилином и еозином (Х&Е) ресецираног плућног ткива (скала бар = 50 μм) показује ацинарни образац раста аденокарцинома плућа.Стрелице показују нодуле откривене на ЦТ сликама.Х&Е слике су репрезентативне слике више (>3) микроскопских поља које је прегледао патолог.
Узети заједно, наши резултати показују потенцијалну вредност биомаркера серумских метаболита у диференцијалној дијагнози плућних нодула, што може представљати изазове приликом евалуације ЦТ скрининга.
На основу валидираног панела диференцијалних метаболита, настојали смо да идентификујемо биолошке корелате главних метаболичких промена.Анализа обогаћивања КЕГГ путева од стране МетабоАналист-а је идентификовала 6 уобичајених значајно измењених путева између две дате групе (ЛА наспрам ХЦ и ЛА наспрам БН, прилагођено п ≤ 0,001, ефекат > 0,01).Ове промене карактерише поремећај метаболизма пирувата, метаболизма триптофана, метаболизма ниацина и никотинамида, гликолизе, ТЦА циклуса и метаболизма пурина (слика 5а).Затим смо даље извршили циљану метаболомику да бисмо потврдили велике промене користећи апсолутну квантификацију.Одређивање уобичајених метаболита у често измењеним путевима помоћу троструке квадруполне масене спектрометрије (ККК) коришћењем аутентичних стандарда метаболита.Демографске карактеристике циљног узорка метаболомске студије укључене су у додатну табелу 4. У складу са нашим глобалним резултатима метаболомике, квантитативна анализа је потврдила да су хипоксантин и ксантин, пируват и лактат повећани у ЛА у поређењу са БН и ХЦ (Слика 5б, ц, п <0,05).Међутим, нису нађене значајне разлике у овим метаболитима између БН и ХЦ.
Анализа КЕГГ пута обогаћивања значајно различитих метаболита у ЛА групи у поређењу са БН и ХЦ групама.Коришћен је двострани Глобалтест, а п вредности су подешене применом Холм-Бонферони методе (прилагођено п ≤ 0,001 и величина ефекта > 0,01).б–д Виолин графикони који показују нивое хипоксантина, ксантина, лактата, пирувата и триптофана у серуму ХЦ, БН и ЛА одређене помоћу ЛЦ-МС/МС (н = 70 по групи).Беле и црне испрекидане линије означавају медијану и квартил, респективно.е Виолин дијаграм који приказује нормализовану Лог2ТПМ (транскрипти на милион) мРНК експресије СЛЦ7А5 и КПРТ у аденокарциному плућа (н = 513) у поређењу са нормалним плућним ткивом (н = 59) у скупу података ЛУАД-ТЦГА.Бела кутија представља интерквартилни опсег, хоризонтална црна линија у центру представља медијану, а вертикална црна линија која се протеже од оквира представља интервал поверења од 95% (ЦИ).ф Пирсонова корелација експресије СЛЦ7А5 и ГАПДХ у аденокарциному плућа (н = 513) и нормалном плућном ткиву (н = 59) у скупу података ТЦГА.Сива област представља 95% ЦИ.р, Пирсонов коефицијент корелације.г Нормализовани нивои ћелијског триптофана у А549 ћелијама трансфицираним неспецифичном контролом схРНА (НЦ) и схСЛЦ7А5 (Сх1, Сх2) утврђеним помоћу ЛЦ-МС/МС.Приказана је статистичка анализа пет биолошки независних узорака у свакој групи.х Ћелијски нивои НАДт (укупни НАД, укључујући НАД+ и НАДХ) у А549 ћелијама (НЦ) и СЛЦ7А5 срушеним А549 ћелијама (Сх1, Сх2).Приказана је статистичка анализа три биолошки независна узорка у свакој групи.и Гликолитичка активност А549 ћелија пре и после пада СЛЦ7А5 мерена је брзином екстрацелуларне ацидификације (ЕЦАР) (н = 4 биолошки независна узорка по групи).2-ДГ,2-деокси-Д-глукоза.Двострани Студентов т тест је коришћен у (б–х).У (г–и), траке грешке представљају средњу вредност ± СД, сваки експеримент је изведен три пута независно и резултати су били слични.Изворни подаци се пружају у облику датотека изворних података.
Узимајући у обзир значајан утицај измењеног метаболизма триптофана у ЛА групи, такође смо проценили нивое триптофана у серуму у ХЦ, БН и ЛА групама користећи ККК.Открили смо да је триптофан у серуму смањен у ЛА у поређењу са ХЦ или БН (п < 0,001, слика 5д), што је у складу са претходним налазима да су нивои триптофана у циркулацији нижи код пацијената са карциномом плућа него код здравих контрола из контролне групе33,34 ,35.Друга студија која је користила ПЕТ/ЦТ трагач 11Ц-метил-Л-триптофана открила је да је време задржавања сигнала триптофана у ткиву рака плућа значајно повећано у поређењу са бенигним лезијама или нормалним ткивом36.Претпостављамо да смањење триптофана у ЛА серуму може одражавати активни унос триптофана ћелијама рака плућа.
Такође је познато да је крајњи производ кинуренинског пута катаболизма триптофана НАД+37,38, који је важан супстрат за реакцију глицералдехид-3-фосфата са 1,3-бисфосфоглицератом у гликолизи39.Док су се претходне студије фокусирале на улогу катаболизма триптофана у имунолошкој регулацији, настојали смо да разјаснимо интеракцију између дисрегулације триптофана и гликолитичких путева уочених у овој студији.Познато је да је породица 7 транспортера растворених материја 5 (СЛЦ7А5) транспортер триптофана43,44,45.Фосфорибозилтрансфераза кинолинске киселине (КПРТ) је ензим који се налази низводно од кинуренин пута који претвара хинолинску киселину у НАМН46.Инспекција ЛУАД ТЦГА скупа података открила је да су и СЛЦ7А5 и КПРТ значајно повећани у туморском ткиву у поређењу са нормалним ткивом (Слика 5е).Ово повећање је примећено у стадијумима И и ИИ, као и стадијумима ИИИ и ИВ аденокарцинома плућа (допунска слика 11), што указује на ране поремећаје у метаболизму триптофана повезане са туморигенезом.
Поред тога, скуп података ЛУАД-ТЦГА показао је позитивну корелацију између експресије мРНА СЛЦ7А5 и ГАПДХ у узорцима пацијената са раком (р = 0,45, п = 1,55Е-26, слика 5ф).Насупрот томе, није пронађена значајна корелација између оваквих генских потписа у нормалном плућном ткиву (р = 0,25, п = 0,06, слика 5ф).Обарање СЛЦ7А5 (додатна слика 12) у ћелијама А549 значајно је смањило нивое ћелијског триптофана и НАД(Х) (слика 5г, х), што је резултирало ослабљеном гликолитичком активношћу мереном екстрацелуларном брзином ацидификације (ЕЦАР) (слика 1).5и).Стога, на основу метаболичких промена у серуму и ин витро детекције, претпостављамо да метаболизам триптофана може произвести НАД+ путем кинуренин пута и играти важну улогу у промовисању гликолизе код рака плућа.
Студије су показале да велики број неодређених плућних чворова откривених ЛДЦТ-ом може довести до потребе за додатним тестирањем као што су ПЕТ-ЦТ, биопсија плућа и прекомерно лечење због лажно позитивне дијагнозе малигнитета.31 Као што је приказано на слици 6, наша студија је идентификовала панел серумских метаболита са потенцијалном дијагностичком вредношћу који могу побољшати стратификацију ризика и накнадно управљање плућним чворовима откривеним ЦТ-ом.
Плућни чворови се процењују коришћењем компјутеризоване томографије малих доза (ЛДЦТ) са карактеристикама снимања које указују на бенигне или малигне узроке.Неизвестан исход нодула може довести до честих контролних посета, непотребних интервенција и прекомерног лечења.Укључивање серумских метаболичких класификатора са дијагностичком вредношћу може побољшати процену ризика и накнадно лечење плућних чворова.ПЕТ позитронска емисиона томографија.
Подаци из америчке НЛСТ студије и европске студије НЕЛСОН сугеришу да скрининг група са високим ризиком са ниском дозом компјутеризоване томографије (ЛДЦТ) може смањити смртност од рака плућа1,3.Међутим, процена ризика и накнадно клиничко лечење великог броја случајних плућних чворова откривених ЛДЦТ остају најизазовнији.Главни циљ је оптимизација исправне класификације постојећих протокола заснованих на ЛДЦТ уградњом поузданих биомаркера.
Одређени молекуларни биомаркери, као што су метаболити у крви, идентификовани су поређењем рака плућа са здравим контролама15,17.У овој студији, фокусирали смо се на примену анализе серумске метаболомике да бисмо разликовали бенигне и малигне плућне нодуле случајно откривене ЛДЦТ-ом.Упоредили смо глобални серумски метаболом здравих контролних (ХЦ), бенигних плућних чворова (БН) и стадијума И плућног аденокарцинома (ЛА) користећи УПЛЦ-ХРМС анализу.Открили смо да ХЦ и БН имају сличне метаболичке профиле, док је ЛА показао значајне промене у поређењу са ХЦ и БН.Идентификовали смо два скупа серумских метаболита који разликују ЛА од ХЦ и БН.
Тренутна шема идентификације бенигних и малигних чворова заснована на ЛДЦТ-у углавном се заснива на величини, густини, морфологији и брзини раста нодула током времена30.Претходне студије су показале да је величина чворова уско повезана са вероватноћом рака плућа.Чак и код пацијената са високим ризиком, ризик од малигнитета у чворовима <6 мм је <1%.Ризик од малигнитета за чворове величине 6 до 20 мм креће се од 8% до 64%30.Стога, Флеисцхнер Социети препоручује гранични пречник од 6 мм за рутинско ЦТ праћење.29 Међутим, процена ризика и збрињавање неодређених плућних нодула (ИПН) већих од 6 мм нису на адекватан начин 31 .Тренутни третман урођених срчаних болести се обично заснива на пажљивом чекању са честим ЦТ праћењем.
На основу валидираног метаболома, по први пут смо показали преклапање метаболомских потписа између здравих особа и бенигних чворова <6 мм.Биолошка сличност је у складу са претходним ЦТ налазима да је ризик од малигнитета за чворове <6 мм тако низак као и за субјекте без чворова.30 Треба напоменути да наши резултати такође показују да бенигни нодули <6 мм и ≥6 мм имају високе сличност у метаболомским профилима, што сугерише да је функционална дефиниција бенигне етиологије конзистентна без обзира на величину нодула.Дакле, савремени дијагностички панели метаболита у серуму могу да обезбеде један тест као тест за искључење када се нодули иницијално открију на ЦТ-у и потенцијално смањују серијски мониторинг.Истовремено, исти панел метаболичких биомаркера разликовао је малигне чворове величине ≥6 мм од бенигних чворова и пружио тачна предвиђања за ИПН сличне величине и двосмислених морфолошких карактеристика на ЦТ сликама.Овај класификатор серумског метаболизма показао се добро у предвиђању малигнитета чворова ≥6 мм са АУЦ од 0,927.Узети заједно, наши резултати показују да јединствени серумски метаболомски потписи могу посебно одражавати ране метаболичке промене изазване тумором и да имају потенцијалну вредност као предиктори ризика, независно од величине чворова.
Посебно, аденокарцином плућа (ЛУАД) и карцином сквамозних ћелија (ЛУСЦ) су главни типови карцинома не-малих ћелија плућа (НСЦЛЦ).С обзиром да је ЛУСЦ снажно повезан са употребом дувана47 и ЛУАД је најчешћа хистологија случајних плућних нодула откривених на ЦТ скринингу48, наш модел класификатора је посебно направљен за узорке аденокарцинома стадијума И.Ванг и колеге су се такође фокусирали на ЛУАД и идентификовали девет липидних потписа користећи липидомику да би разликовали рак плућа у раној фази од здравих појединаца17.Тестирали смо тренутни модел класификатора на 16 случајева ЛУСЦ стадијума И и 74 бенигна чвора и приметили ниску тачност предвиђања ЛУСЦ-а (АУЦ 0,776), што сугерише да ЛУАД и ЛУСЦ могу имати сопствене метаболомске потписе.Заиста се показало да се ЛУАД и ЛУСЦ разликују по етиологији, биолошком пореклу и генетским аберацијама49.Према томе, друге врсте хистологије треба да буду укључене у моделе обуке за детекцију рака плућа на основу популације у програмима скрининга.
Овде смо идентификовали шест најчешће измењених путева у аденокарциному плућа у поређењу са здравим контролама и бенигним чворовима.Ксантин и хипоксантин су уобичајени метаболити метаболичког пута пурина.У складу са нашим резултатима, интермедијери повезани са метаболизмом пурина су значајно повећани у серуму или ткивима пацијената са аденокарциномом плућа у поређењу са здравим контролама или пацијентима у преинвазивном стадијуму15,50.Повишени нивои ксантина и хипоксантина у серуму могу одражавати анаболизам који је потребан за ћелије рака које се брзо размножавају.Дисрегулација метаболизма глукозе је добро познато обележје метаболизма рака51.Овде смо приметили значајно повећање пирувата и лактата у ЛА групи у поређењу са ХЦ и БН групом, што је у складу са претходним извештајима о абнормалностима гликолитичког пута у профилима серумског метаболома пацијената са не-малих ћелија рака плућа (НСЦЛЦ) и здраве контроле.резултати су доследни52,53.
Важно је да смо приметили инверзну корелацију између метаболизма пирувата и триптофана у серуму аденокарцинома плућа.Нивои триптофана у серуму су смањени у ЛА групи у поређењу са ХЦ или БН групом.Занимљиво је да је претходна велика студија која је користила проспективну кохорту открила да су ниски нивои циркулишућег триптофана повезани са повећаним ризиком од рака плућа 54 .Триптофан је есенцијална аминокиселина коју у потпуности добијамо храном.Закључујемо да смањење количине триптофана у серуму код аденокарцинома плућа може одражавати брзо исцрпљивање овог метаболита.Добро је познато да је крајњи производ катаболизма триптофана путем кинуренинског пута извор де ново синтезе НАД+.Пошто се НАД+ производи првенствено путем спасавања, остаје да се утврди значај НАД+ у метаболизму триптофана у здрављу и болести46.Наша анализа базе података ТЦГА показала је да је експресија транспортера растворене супстанце триптофана 7А5 (СЛЦ7А5) значајно повећана код аденокарцинома плућа у поређењу са нормалним контролама и да је у позитивној корелацији са експресијом гликолитичког ензима ГАПДХ.Претходне студије су се углавном фокусирале на улогу катаболизма триптофана у сузбијању антитуморског имунолошког одговора40,41,42.Овде показујемо да инхибиција узимања триптофана обарањем СЛЦ7А5 у ћелијама рака плућа доводи до накнадног смањења ћелијских нивоа НАД и истовременог слабљења гликолитичке активности.Укратко, наша студија пружа биолошку основу за промене у метаболизму серума повезане са малигном трансформацијом аденокарцинома плућа.
ЕГФР мутације су најчешће мутације покретача код пацијената са НСЦЛЦ.У нашој студији смо открили да пацијенти са мутацијом ЕГФР (н = 41) имају укупне метаболомске профиле сличне пацијентима са дивљим типом ЕГФР (н = 31), иако смо открили смањене серумске нивое неких пацијената са мутираним ЕГФР код пацијената са ацилкарнитином.Утврђена функција ацилкарнитина је да транспортује ацил групе из цитоплазме у матрикс митохондрија, што доводи до оксидације масних киселина за производњу енергије 55 .У складу са нашим налазима, недавна студија је такође идентификовала сличне профиле метаболома између ЕГФР мутанта и тумора дивљег типа ЕГФР анализом глобалног метаболома 102 узорка ткива аденокарцинома плућа50.Занимљиво је да је садржај ацилкарнитина такође пронађен у ЕГФР мутантној групи.Према томе, да ли промене у нивоима ацилкарнитина одражавају метаболичке промене изазване ЕГФР-ом и основни молекуларни путеви могу заслужити даље истраживање.
У закључку, наша студија успоставља серумски метаболички класификатор за диференцијалну дијагнозу плућних нодула и предлаже ток рада који може оптимизовати процену ризика и олакшати клиничко управљање засновано на скринингу ЦТ скенирања.
Ову студију је одобрио Етички комитет Универзитетске болнице за рак Сун Јат-сен, Прва придружена болница Универзитета Сун Јат-сен и Етички комитет Универзитетске болнице за рак Џенгџоу.У групама за откривање и интерну валидацију, 174 серума од здравих особа и 244 серума из бенигних чворова прикупљено је од појединаца који су били подвргнути годишњим медицинским прегледима у Одељењу за контролу и превенцију рака, Универзитетски центар за рак Сун Иат-сен, и 166 бенигних нодула.серум.Аденокарциноми у стадијуму И су сакупљени из Центра за рак Универзитета Сун Јат-сен.У кохорти екстерне валидације било је 48 случајева бенигних нодула, 39 случајева аденокарцинома плућа И стадијума из Прве придружене болнице Универзитета Сун Јат-сен и 24 случаја аденокарцинома плућа И стадијума из болнице за рак у Џенгџоу.Универзитетски центар за рак Сун Иат-сен је такође сакупио 16 случајева карцинома плућа И стадијума сквамозних ћелија како би тестирао дијагностичку способност успостављеног метаболичког класификатора (карактеристике пацијената приказане су у Додатној табели 5).Узорци из кохорте открића и кохорте интерне валидације прикупљени су између јануара 2018. и маја 2020. Узорци за кохорту екстерне валидације прикупљени су између августа 2021. и октобра 2022. Да би се пристрасност полова свела на најмању могућу меру, приближно једнак број случајева мушкараца и жена је додељен сваком кохорта.Тим за откривање и тим за интерну ревизију.Пол учесника је одређен на основу самопроцене.Од свих учесника добијен је информисани пристанак и никаква надокнада није дата.Субјекти са бенигним нодулима су били они са стабилним резултатом ЦТ скенирања на 2 до 5 година у време анализе, осим 1 случаја из узорка екстерне валидације, који је сакупљен преоперативно и дијагностикован хистопатолошким путем.Са изузетком хроничног бронхитиса.Случајеви аденокарцинома плућа су прикупљени пре ресекције плућа и потврђени патолошком дијагнозом.Узорци крви наташте су сакупљени у епрувете за одвајање серума без икаквих антикоагуланса.Узорци крви су згрушани 1 сат на собној температури, а затим центрифугирани на 2851 × г током 10 минута на 4 ° Ц да би се сакупио супернатант серума.Аликвоти серума су замрзнути на -80°Ц до екстракције метаболита.Одељење за превенцију рака и медицински преглед Центра за рак Универзитета Сун Јат-сен прикупило је збир серума од 100 здравих давалаца, укључујући једнак број мушкараца и жена старости од 40 до 55 година.Помешане су једнаке запремине сваког узорка донора, добијени базен је аликвотан и чуван на -80°Ц.Смеша серума је коришћена као референтни материјал за контролу квалитета и стандардизацију података.
Референтни серум и узорци теста су одмрзнути, а метаболити екстраховани комбинованом методом екстракције (МТБЕ/метанол/вода) 56 .Укратко, 50 μл серума је помешано са 225 μл ледено хладног метанола и 750 μл ледено хладног метил терц-бутил етра (МТБЕ).Мешајте смешу и инкубирајте на леду 1 сат.Узорци су затим помешани и мешани вортексом са 188 μл воде МС квалитета која садржи интерне стандарде (13Ц-лактат, 13Ц3-пируват, 13Ц-метионин и 13Ц6-изолеуцин, набављени од Цамбридге Исотоп Лабораториес).Смеша је затим центрифугирана на 15.000 × г током 10 минута на 4 ° Ц, а доња фаза је пребачена у две епрувете (125 μЛ свака) за ЛЦ-МС анализу у позитивном и негативном режиму.Коначно, узорак је упарен до сува у вакуумском концентратору велике брзине.
Осушени метаболити су реконституисани у 120 μл 80% ацетонитрила, мешани на вортексу 5 мин и центрифугирани на 15.000 × г током 10 минута на 4 ° Ц.Супернатанти су пребачени у бочице од жутог стакла са микроуметцима за метаболомичке студије.Анализа нециљане метаболомике на платформи течне хроматографије ултра-перформансе и масене спектрометрије високе резолуције (УПЛЦ-ХРМС).Метаболити су раздвојени коришћењем Дионек Ултимате 3000 УПЛЦ система и АЦКУИТИ БЕХ Амиде колоне (2,1 × 100 мм, 1,7 μм, Ватерс).У режиму позитивних јона, мобилне фазе су биле 95% (А) и 50% ацетонитрила (Б), од којих свака садржи 10 ммол/Л амонијум ацетата и 0,1% мравље киселине.У негативном режиму, мобилне фазе А и Б су садржале 95% и 50% ацетонитрила, респективно, обе фазе су садржале 10 ммол/Л амонијум ацетата, пХ = 9. Програм градијента је био следећи: 0–0,5 мин, 2% Б;0,5–12 мин, 2–50% Б;12–14 мин, 50–98% Б;14–16 мин, 98% Б;16–16.1.мин, 98 –2% Б;16,1–20 мин, 2% Б. Колона је одржавана на 40°Ц, а узорак на 10°Ц у аутосамплеру.Брзина протока је била 0,3 мл/мин, запремина ињекције је била 3 μл.К-Екацтиве Орбитрап масени спектрометар (Тхермо Фисхер Сциентифиц) са извором електроспреј јонизације (ЕСИ) радио је у режиму пуног скенирања и у комбинацији са ддМС2 режимом праћења како би се прикупиле велике количине података.Параметри МС су подешени на следећи начин: напон прскања +3,8 кВ/- 3,2 кВ, температура капилара 320°Ц, заштитни гас 40 арб, помоћни гас 10 арб, температура грејача сонде 350°Ц, опсег скенирања 70–1050 м/х, резолуција.70 000. Подаци су добијени коришћењем Ксцалибур 4.1 (Тхермо Фисхер Сциентифиц).
Да би се проценио квалитет података, скупљени узорци контроле квалитета (КЦ) су генерисани уклањањем аликвота од 10 μЛ супернатанта из сваког узорка.Шест убризгавања узорака контроле квалитета анализирано је на почетку аналитичке секвенце да би се проценила стабилност УПЛЦ-МС система.Узорци за контролу квалитета се затим периодично уносе у серију.Свих 11 серија узорака серума у овој студији анализирано је помоћу ЛЦ-МС.Аликвоти мешавине серума од 100 здравих донора коришћени су као референтни материјал у одговарајућим серијама за праћење процеса екстракције и прилагођавање ефеката серије на шаржу.Нециљана метаболомичка анализа кохорте открића, кохорте интерне валидације и кохорте екстерне валидације обављена је у Центру за метаболомику Универзитета Сун Иат-сен.Екстерна лабораторија Центра за анализу и тестирање технолошког универзитета Гуангдонг такође је анализирала 40 узорака из екстерне кохорте да би тестирала перформансе модела класификатора.
Након екстракције и реконституције, мерена је апсолутна квантификација серумских метаболита коришћењем течне хроматографије ултра високих перформанси-тандем масене спектрометрије (Агилент 6495 троструки квадрупол) са извором јонизације електроспрејом (ЕСИ) у режиму праћења вишеструких реакција (МРМ).Колона АЦКУИТИ БЕХ Амиде (2,1 × 100 мм, 1,7 μм, Ватерс) је коришћена за одвајање метаболита.Мобилна фаза се састојала од 90% (А) и 5% ацетонитрила (Б) са 10 ммол/Л амонијум ацетата и 0,1% раствора амонијака.Програм градијента је био следећи: 0–1,5 мин, 0% Б;1,5–6,5 мин, 0–15% Б;6,5–8 мин, 15% Б;8–8,5 мин, 15%–0% Б;8,5–11,5 мин, 0% Б.Колона је одржавана на 40 °Ц, а узорак на 10 °Ц у аутосамплеру.Брзина протока је била 0,3 мЛ/мин, а запремина ињекције је била 1 μЛ.МС параметри су постављени на следећи начин: капиларни напон ±3,5 кВ, притисак распршивача 35 пси, проток гаса у омотачу 12 Л/мин, температура гаса у омотачу 350°Ц, температура гаса за сушење 250°Ц и проток гаса за сушење 14 л/мин.МРМ конверзије триптофана, пирувата, лактата, хипоксантина и ксантина биле су 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 и 151,0–107.9 респективно.Подаци су прикупљени коришћењем Масс Хунтер Б.07.00 (Агилент Тецхнологиес).За узорке серума, триптофан, пируват, лактат, хипоксантин и ксантин су квантификовани коришћењем калибрационих кривуља раствора стандардне смеше.За узорке ћелија, садржај триптофана је нормализован на интерни стандард и масу ћелијског протеина.
Екстракција пика (м/з и време задржавања (РТ)) је изведена коришћењем Цомпоунд Дисцовери 3.1 и ТрацеФиндер 4.0 (Тхермо Фисхер Сциентифиц).Да би се елиминисале потенцијалне разлике између серија, сваки карактеристичан пик тестног узорка је подељен са карактеристичним пиком референтног материјала из исте серије да би се добила релативна количина.Релативна стандардна одступања интерних стандарда пре и после стандардизације приказана су у Додатној табели 6. Разлике између две групе су биле окарактерисане стопом лажног откривања (ФДР<0,05, Вилцокон сигнед ранк тест) и променом пута (>1,2 или <0,83).Необрађени МС подаци екстрахованих карактеристика и референтни серумско кориговани МС подаци приказани су у Додатним подацима 1 и Додатним подацима 2, респективно.Означавање врха је извршено на основу четири дефинисана нивоа идентификације, укључујући идентификоване метаболите, наводно означена једињења, претпостављено окарактерисане класе једињења и непозната једињења 22 .На основу претраживања базе података у Цомпоунд Дисцовери 3.1 (мзЦлоуд, ХМДБ, Цхемспидер), биолошка једињења са МС/МС која се подударају са валидираним стандардима или напоменама тачног подударања у мзЦлоуд (резултат > 85) или Цхемспидер су коначно одабрана као посредници између диференцијалног метаболома.Напомене о врхунцу за сваку карактеристику су укључене у додатне податке 3. МетабоАналист 5.0 је коришћен за униваријантну анализу збирно нормализованог обиља метаболита.МетабоАналист 5.0 је такође проценио анализу обогаћивања КЕГГ пута на основу значајно различитих метаболита.Анализа главних компоненти (ПЦА) и парцијална дискриминантна анализа најмањих квадрата (ПЛС-ДА) анализиране су коришћењем софтверског пакета роплс (в.1.26.4) са нормализацијом стека и аутоматским скалирањем.Оптимални модел биомаркера метаболита за предвиђање малигнитета чворова генерисан је коришћењем бинарне логистичке регресије са најмањим апсолутним скупљањем и оператором селекције (ЛАССО, Р пакет в.4.1-3).Перформансе дискриминантног модела у сетовима за детекцију и валидацију карактерисане су проценом АУЦ на основу РОЦ анализе према пРОЦ пакету (в.1.18.0.).Оптимална граница вероватноће је добијена на основу максималног Иоуденовог индекса модела (осетљивост + специфичност – 1).Узорци са вредностима мањим или већим од прага биће предвиђени као бенигни нодули и аденокарцином плућа, респективно.
А549 ћелије (#ЦЦЛ-185, Америцан Типе Цултуре Цоллецтион) су узгајане у Ф-12К медијуму који садржи 10% ФБС.У лентивирусни вектор пЛКО.1-пуро убачене су кратке секвенце РНА (схРНА) које циљају на СЛЦ7А5 и нециљану контролу (НЦ).Антисенс секвенце схСЛЦ7А5 су следеће: Сх1 (5′-ГГАГАААЦЦТГАТГААЦАГТТ-3′), Сх2 (5′-ГЦЦГТГГАЦТТЦГГГААЦТАТ-3′).Антитела на СЛЦ7А5 (#5347) и тубулин (#2148) су купљена од Целл Сигналинг Тецхнологи.Антитела на СЛЦ7А5 и тубулин су коришћена у разблажењу од 1:1000 за Вестерн блот анализу.
Сеахорсе КСФ гликолитички стрес тест мери нивое екстрацелуларне ацидификације (ЕЦАР).У тесту, глукоза, олигомицин А и 2-ДГ су давани узастопно да би се тестирао ћелијски гликолитички капацитет измерен помоћу ЕЦАР-а.
А549 ћелије трансфектоване са нециљаном контролом (НЦ) и схСЛЦ7А5 (Сх1, Сх2) су постављене преко ноћи у посуде пречника 10 цм.Ћелијски метаболити су екстраховани са 1 мл ледено хладног 80% воденог метанола.Ћелије у раствору метанола су остругане, сакупљене у нову епрувету и центрифугиране на 15.000 × г током 15 минута на 4 ° Ц.Сакупити 800 µл супернатанта и осушити помоћу вакуумског концентратора велике брзине.Осушене пелете метаболита су затим анализиране на нивое триптофана коришћењем ЛЦ-МС/МС као што је горе описано.Ћелијски нивои НАД(Х) у А549 ћелијама (НЦ и схСЛЦ7А5) мерени су коришћењем квантитативног НАД+/НАДХ колориметријског комплета (#К337, БиоВисион) према упутствима произвођача.Нивои протеина су мерени за сваки узорак да би се нормализовала количина метаболита.
За прелиминарно одређивање величине узорка нису коришћене статистичке методе.Претходне метаболомске студије које су имале за циљ откривање биомаркера15,18 сматране су мерилима за одређивање величине, и у поређењу са овим извештајима, наш узорак је био адекватан.Ниједан узорак није искључен из кохорте студије.Узорци серума су насумично распоређени у групу за откривање (306 случајева, 74,6%) и групу за интерну валидацију (104 случаја, 25,4%) за нециљане метаболомичке студије.Такође смо насумично одабрали 70 случајева из сваке групе из скупа открића за циљане метаболомске студије.Истраживачи су били заслепљени за доделу група током ЛЦ-МС прикупљања и анализе података.Статистичке анализе метаболомских података и ћелијских експеримената су описане у одговарајућим одељцима Резултати, Легенде слика и Методе.Квантификација ћелијског триптофана, НАДТ и гликолитичке активности изведена је три пута независно са идентичним резултатима.
За више информација о дизајну студије, погледајте сажетак извештаја о природном портфолију који је повезан са овим чланком.
Необрађени МС подаци екстрахованих карактеристика и нормализовани МС подаци референтног серума приказани су у Додатним подацима 1 и Додатним подацима 2, респективно.Напомене о вршним вредностима за диференцијалне карактеристике су представљене у Додатним подацима 3. Скуп података ЛУАД ТЦГА се може преузети са хттпс://портал.гдц.цанцер.гов/.Улазни подаци за цртање графикона су дати у изворним подацима.Изворни подаци су дати за овај чланак.
Национална студијска група за скрининг плућа, итд. Смањење смртности од рака плућа помоћу компјутерске томографије малих доза.Северна Енглеска.Ј. Мед.365, 395–409 (2011).
Крамер, БС, Берг, КД, Аберле, ДР и Пропхет, ПЦ Скрининг карцинома плућа коришћењем спиралне ЦТ ниске дозе: резултати Националне студије скрининга плућа (НЛСТ).Ј. Мед.Екран 18, 109–111 (2011).
Де Конинг, ХЈ, ет ал.Смањење морталитета од рака плућа волуметријским ЦТ скринингом у рандомизованом испитивању.Северна Енглеска.Ј. Мед.382, 503–513 (2020).
Време поста: 18.09.2023