Диференцијална дијагноза плућних нодула идентификованих компјутеризованом томографијом (ЦТ) остаје изазов у клиничкој пракси. Овде карактеришемо глобални метаболом 480 узорака серума, укључујући здраве контроле, бенигне плућне нодуле и аденокарцином плућа стадијума I. Аденокарциноми показују јединствене метаболомске профиле, док бенигни нодули и здраве особе имају велику сличност у метаболомским профилима. У групи за откриће (n = 306), идентификован је скуп од 27 метаболита за разликовање бенигних и малигних нодула. AUC дискриминантног модела у групама интерне валидације (n = 104) и екстерне валидације (n = 111) био је 0,915 и 0,945, респективно. Анализа путање је открила повећане гликолитичке метаболите повезане са смањеним триптофаном у серуму плућног аденокарцинома у поређењу са бенигним нодулима и здравим контролама, и сугерисала да унос триптофана подстиче гликолизу у ћелијама рака плућа. Наша студија истиче вредност биомаркера серумских метаболита у процени ризика од плућних нодула откривених ЦТ-ом.
Рана дијагноза је кључна за побољшање стопе преживљавања пацијената оболелих од рака. Резултати Националног испитивања скрининга рака плућа у САД (NLST) и Европске NELSON студије показали су да скрининг компјутеризованом томографијом ниских доза (LDCT) може значајно смањити морталитет од рака плућа код група високог ризика1,2,3. Од широко распрострањене употребе LDCT-а за скрининг рака плућа, учесталост случајних радиографских налаза асимптоматских плућних чворића наставља да расте4. Плућни чворићи се дефинишу као фокалне непрозирности пречника до 3 цм5. Суочавамо се са потешкоћама у процени вероватноће малигнитета и раду са великим бројем плућних чворића случајно откривених на LDCT-у. Ограничења CT-а могу довести до честих контролних прегледа и лажно позитивних резултата, што доводи до непотребне интервенције и прекомерног лечења6. Стога је потребан развој поузданих и корисних биомаркера за правилно идентификовање рака плућа у раним фазама и диференцирање већине бенигних чворића при почетном откривању7.
Свеобухватна молекуларна анализа крви (серум, плазма, мононуклеарне ћелије периферне крви), укључујући геномику, протеомику или метилацију ДНК8,9,10, довела је до растућег интересовања за откривање дијагностичких биомаркера за рак плућа. У међувремену, метаболомички приступи мере ћелијске крајње производе који су под утицајем ендогених и егзогених дејстава и стога се примењују за предвиђање почетка и исхода болести. Течна хроматографија-тандем масена спектрометрија (LC-MS) је широко коришћена метода за метаболомичке студије због своје високе осетљивости и великог динамичког опсега, који може да покрије метаболите са различитим физичко-хемијским својствима11,12,13. Иако је глобална метаболомичка анализа плазме/серума коришћена за идентификацију биомаркера повезаних са дијагнозом рака плућа14,15,16,17 и ефикасношћу лечења,18 класификатори серумских метаболита за разликовање бенигних и малигних плућних чворића још увек треба да се добро проуче. -масивна истраживања.
Аденокарцином и сквамозноћелијски карцином су два главна подтипа неситноћелијског карцинома плућа (NSCLC). Различити ЦТ скрининг тестови указују да је аденокарцином најчешћи хистолошки тип рака плућа1,19,20,21. У овој студији, користили смо ултра-перформансну течну хроматографију-масну спектрометрију високе резолуције (UPLC-HRMS) да бисмо извршили метаболомску анализу на укупно 695 узорака серума, укључујући здраве контроле, бенигне плућне нодуле и ЦТ-детектоване ≤3 цм. Скрининг за аденокарцином плућа стадијума I. Идентификовали смо панел серумских метаболита који разликују аденокарцином плућа од бенигних нодула и здравих контрола. Анализа обогаћивања путање показала је да су абнормални метаболизам триптофана и глукозе уобичајене промене код аденокарцинома плућа у поређењу са бенигним нодулима и здравим контролама. Коначно, успоставили смо и валидирали серумски метаболички класификатор са високом специфичношћу и осетљивошћу за разликовање малигних и бенигних плућних нодула откривених ЛДЦТ-ом, што може помоћи у раној диференцијалној дијагнози и процени ризика.
У овој студији, ретроспективно су прикупљени узорци серума усклађених по полу и старости од 174 здраве контролне особе, 292 пацијента са бенигним плућним чворићима и 229 пацијената са аденокарциномом плућа стадијума I. Демографске карактеристике 695 испитаника приказане су у Додатној табели 1.
Као што је приказано на слици 1а, укупно 480 узорака серума, укључујући 174 здравих контролних особа (ЗК), 170 бенигних нодула (БН) и 136 узорака аденокарцинома плућа (АПК) стадијума I, прикупљено је у Онколошком центру Универзитета Сун Јат-сен. Кохорта за откриће за нециљано метаболомско профилисање коришћењем ултра-перформансне течне хроматографије са масеном спектрометријом високе резолуције (UPLC-HRMS). Као што је приказано на Додатној слици 1, идентификовани су различити метаболити између АПК и АПК, АПК и АПК како би се успоставио модел класификације и даље истражила анализа диференцијалних путева. 104 узорка које је прикупио Онколошки центар Универзитета Сун Јат-сен и 111 узорака које су прикупиле две друге болнице подвргнути су интерној и екстерној валидацији, респективно.
а Студијска популација у кохорти открића која је подвргнута глобалној анализи метаболомике серума коришћењем ултра-перформансне течне хроматографије-масене спектрометрије високе резолуције (UPLC-HRMS). б Дискриминантна анализа парцијалних најмањих квадрата (PLS-DA) укупног метаболома 480 узорака серума из студијске кохорте, укључујући здраве контроле (HC, n = 174), бенигне нодуле (BN, n = 170) и аденокарцином плућа стадијума I (Лос Анђелес, n = 136). +ESI, режим позитивне електроспреј јонизације, -ESI, режим негативне електроспреј јонизације. ц–е Метаболити са значајно различитим обиљем у две дате групе (двострани Вилкоксонов тест рангирања са знаком, p вредност прилагођена стопи лажног открића, FDR <0,05) су приказани црвеном (промена пута > 1,2) и плавом бојом (промена пута < 0,83). ) приказано на графичком приказу вулкана. ф Хијерархијска топлотна мапа кластеровања која приказује значајне разлике у броју анотираних метаболита између LA и BN. Изворни подаци се дају у облику датотека са изворним подацима.
Укупни серумски метаболом 174 HC, 170 BN и 136 LA у групи открића анализиран је коришћењем UPLC-HRMS анализе. Прво показујемо да се узорци контроле квалитета (QC) чврсто групишу у центру модела ненадзиране анализе главних компоненти (PCA), што потврђује стабилност учинка тренутне студије (Додатна слика 2).
Као што је приказано у анализи парцијалних најмањих квадрата-дискриминантне анализе (PLS-DA) на слици 1б, открили смо да постоје јасне разлике између LA и BN, LA и HC у позитивном (+ESI) и негативном (−ESI) режиму електроспреј јонизације. Међутим, нису пронађене значајне разлике између BN и HC у +ESI и -ESI условима.
Пронашли смо 382 диференцијалне карактеристике између LA и HC, 231 диференцијалну карактеристику између LA и BN и 95 диференцијалних карактеристика између BN и HC (Вилкоксонов тест означених рангова, FDR <0,05 и вишеструке промене >1,2 или <0,83) (Слика .1c-e). Врхови су даље анотирани (Додатни подаци 3) у односу на базу података (mzCloud/HMDB/Chemspider библиотека) помоћу m/z вредности, времена задржавања и претраге масеног спектра фрагментације (детаљи описани у одељку Методе) 22. Коначно, идентификовано је 33 и 38 анотираних метаболита са значајним разликама у обиљу за LA у односу на BN (Слика 1f и Додатна табела 2) и LA у односу на HC (Додатна слика 3 и Додатна табела 2), респективно. Насупрот томе, само 3 метаболита са значајним разликама у обиљу идентификована су у BN и HC (Додатна табела 2), што је у складу са преклапањем између BN и HC у PLS-DA. Ови различити метаболити покривају широк спектар биохемијских једињења (Допунска слика 4). Узети заједно, ови резултати показују значајне промене у серумском метаболому које одражавају малигну трансформацију рака плућа у раном стадијуму у поређењу са бенигним плућним чворићима или здравим субјектима. У међувремену, сличност серумског метаболома BN и HC сугерише да бенигни плућни чворићи могу делити многе биолошке карактеристике са здравим субјектима. С обзиром на то да су мутације гена рецептора епидермалног фактора раста (EGFR) честе код плућног аденокарцинома подтипа 23, покушали смо да утврдимо утицај мутација покретача на серумски метаболом. Затим смо анализирали укупни метаболомски профил 72 случаја са EGFR статусом у групи плућног аденокарцинома. Занимљиво је да смо пронашли упоредиве профиле између пацијената са EGFR мутантом (n = 41) и пацијената са EGFR дивљим типом (n = 31) у PCA анализи (Допунска слика 5а). Међутим, идентификовали смо 7 метаболита чија је количина значајно измењена код пацијената са EGFR мутацијом у поређењу са пацијентима са дивљим типом EGFR-а (t-тест, p < 0,05 и промена вишеструко > 1,2 или < 0,83) (Додатна слика 5б). Већина ових метаболита (5 од 7) су ацилкарнитини, који играју важну улогу у путевима оксидације масних киселина.
Као што је илустровано у току рада приказаном на слици 2а, биомаркери за класификацију нодула добијени су коришћењем оператора најмањег апсолутног скупљања и селекције засноване на 33 различита метаболита идентификованих у ЛА (н = 136) и БН (н = 170). Најбоља комбинација варијабли (LASSO) – бинарни логистички регресиони модел. Десетострука унакрсна валидација је коришћена за тестирање поузданости модела. Селекција варијабли и регуларизација параметара су подешени казном за максимизацију вероватноће са параметром λ24. Глобална метаболомичка анализа је даље извршена независно у групама за интерну валидацију (н = 104) и екстерну валидацију (н = 111) како би се тестирале перформансе класификације дискриминантног модела. Као резултат тога, 27 метаболита у скупу за откривање је идентификовано као најбољи дискриминантни модел са највећом средњом вредношћу AUC (слика 2б), међу којима је 9 имало повећану активност, а 18 смањену активност у ЛА у поређењу са БН (слика 2ц).
Ток рада за изградњу класификатора плућних нодула, укључујући избор најбољег панела серумских метаболита у скупу за откривање коришћењем бинарног логистичког регресионог модела путем десетоструке унакрсне валидације и процену предиктивних перформанси у скуповима за интерну и екстерну валидацију. б Статистика унакрсне валидације LASSO регресионог модела за избор метаболичког биомаркера. Бројеви дати горе представљају просечан број биомаркера одабраних при датом λ. Црвена испрекидана линија представља просечну вредност AUC на одговарајућој ламбда. Сиве траке грешке представљају минималне и максималне вредности AUC. Испрекидана линија означава најбољи модел са 27 одабраних биомаркера. AUC, површина испод криве ROC (Receiver Operating Characteristic). ц Промене бројева 27 одабраних метаболита у LA групи у поређењу са BN групом у групи за откривање. Црвена колона – активација. Плава колона представља пад. д–ф ROC (Receiver Operating Characteristic) криве које приказују снагу дискриминантног модела на основу 27 комбинација метаболита у скуповима за откривање, интерне и екстерне валидације. Изворни подаци су дати у облику датотека изворних података.
Модел предвиђања је креиран на основу пондерисаних коефицијената регресије ових 27 метаболита (Додатна табела 3). ROC анализа заснована на ових 27 метаболита дала је вредност површине испод криве (AUC) од 0,933, осетљивост групе за откриће била је 0,868, а специфичност 0,859 (Сл. 2д). У међувремену, међу 38 анотираних диференцијалних метаболита између LA и HC, скуп од 16 метаболита постигао је AUC од 0,902 са осетљивошћу од 0,801 и специфичношћу од 0,856 у разликовању LA од HC (Додатна слика 6а-ц). Такође су упоређене вредности AUC засноване на различитим праговима промене прегиба за диференцијалне метаболите. Открили смо да је модел класификације најбоље показао разликовање између LA и BN (HC) када је ниво промене прегиба подешен на 1,2 наспрам 1,5 или 2,0 (Додатна слика 7а,б). Модел класификације, заснован на 27 група метаболита, даље је валидиран у интерним и екстерним кохортама. AUC је био 0,915 (сензитивност 0,867, специфичност 0,811) за интерну валидацију и 0,945 (сензитивност 0,810, специфичност 0,979) за екстерну валидацију (Сл. 2е, ф). Да би се проценила међулабораторијска ефикасност, 40 узорака из екстерне кохорте анализирано је у екстерној лабораторији као што је описано у одељку Методе. Тачност класификације достигла је AUC од 0,925 (Додатна слика 8). Пошто је сквамозноћелијски карцином плућа (LUSC) други најчешћи подтип неситноћелијског карцинома плућа (NSCLC) после аденокарцинома плућа (LUAD), такође смо тестирали валидирану потенцијалну корисност метаболичких профила. BN и 16 случајева LUSC. AUC дискриминације између LUSC и BN био је 0,776 (Додатна слика 9), што указује на слабију способност у поређењу са дискриминацијом између LUAD и BN.
Студије су показале да величина нодула на ЦТ снимцима позитивно корелира са вероватноћом малигнитета и остаје главни фактор који одређује лечење нодула25,26,27. Анализа података из велике кохорте НЕЛСОН скрининг студије показала је да је ризик од малигнитета код испитаника са чворовима <5 мм био чак сличан оном код испитаника без чворова28. Стога је минимална величина која захтева редовно ЦТ праћење 5 мм, како препоручује Британско торакално друштво (БТС), и 6 мм, како препоручује Флајшнерово друштво29. Међутим, нодули већи од 6 мм и без очигледних бенигних карактеристика, названи неодређени плућни нодули (ИПН), остају главни изазов у процени и лечењу у клиничкој пракси30,31. Затим смо испитали да ли величина нодула утиче на метаболомске потписе користећи обједињене узорке из кохорти за откривање и интерну валидацију. Фокусирајући се на 27 валидираних биомаркера, прво смо упоредили ПЦА профиле метаболома ХЦ и БН испод 6 мм. Утврдили смо да се већина података за HC и BN преклапа, што показује да су нивои метаболита у серуму слични у обе групе (Сл. 3а). Мапе карактеристика у различитим распонима величина остале су очуване код BN и LA (Сл. 3б, ц), док је примећено раздвајање између малигних и бенигних нодула у распону од 6–20 мм (Сл. 3д). Ова кохорта је имала AUC од 0,927, специфичност од 0,868 и осетљивост од 0,820 за предвиђање малигнитета нодула величине 6 до 20 мм (Сл. 3е, ф). Наши резултати показују да класификатор може да обухвати метаболичке промене изазване раном малигном трансформацијом, без обзира на величину нодула.
ад Поређење PCA профила између одређених група на основу метаболичког класификатора од 27 метаболита. CC и BN < 6 mm. b BN < 6 mm у односу на BN 6–20 mm. у LA 6–20 mm у односу на LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm и LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Крива ROC (Receiver Operating Characteristic) која приказује перформансе дискриминантног модела за нодуле величине 6–20 mm. f Вредности вероватноће су израчунате на основу логистичког регресионог модела за нодуле величине 6–20 mm. Сива испрекидана линија представља оптималну граничну вредност (0,455). Горе наведени бројеви представљају проценат случајева пројектованих за Лос Анђелес. Користите двострани Студентов t-тест. PCA, анализа главних компоненти. AUC површина испод криве. Изворни подаци су дати у облику изворних датотека са подацима.
Четири узорка (старости 44–61 године) са сличним величинама плућних чворова (7–9 мм) су даље одабрана да би се илустровале перформансе предложеног модела предвиђања малигнитета (Сл. 4а, б). При почетном скринингу, Случај 1 се јавио као чврсти чвор са калцификацијом, карактеристиком повезаном са бенигнитетом, док се Случај 2 јавио као неодређени делимично чврсти чвор без очигледних бенигних карактеристика. Три рунде праћења ЦТ скенирања показале су да су ови случајеви остали стабилни током периода од 4 године и стога су сматрани бенигним чворовима (Сл. 4а). У поређењу са клиничком евалуацијом серијских ЦТ скенирања, анализа једнократних метаболита серума са тренутним моделом класификатора брзо и исправно је идентификовала ове бенигне чворове на основу вероватносних ограничења (Табела 1). Слика 4б у случају 3 приказује чвор са знацима плеуралне ретракције, која је најчешће повезана са малигнитетом32. Случај 4 се јавио као неодређени делимично чврсти чвор без доказа о бенигном узроку. Сви ови случајеви су предвиђени као малигни према моделу класификатора (Табела 1). Процена аденокарцинома плућа је доказана хистопатолошким прегледом након операције ресекције плућа (Сл. 4б). За спољашњи валидациони скуп, метаболички класификатор је тачно предвидео два случаја неодређених плућних нодула већих од 6 мм (Додатна слика 10).
ЦТ снимци аксијалног прозора плућа два случаја бенигних нодула. У случају 1, ЦТ скен након 4 године показао је стабилан чврсти нодул величине 7 мм са калцификацијом у доњем десном режњу. У случају 2, ЦТ скен након 5 година открио је стабилан, делимично чврст нодул пречника 7 мм у горњем десном режњу. б Аксијални ЦТ снимци плућа и одговарајуће патолошке студије два случаја аденокарцинома стадијума I пре ресекције плућа. Случај 3 открио је нодул пречника 8 мм у горњем десном режњу са плеуралном ретракцијом. Случај 4 открио је делимично чврст нодул типа мат стакла величине 9 мм у горњем левом режњу. Бојење ресетованог плућног ткива хематоксилином и еозином (Х&Е) (скала = 50 μм) демонстрира ацинарни образац раста аденокарцинома плућа. Стрелице означавају нодуле откривене на ЦТ снимцима. Х&Е снимци су репрезентативне слике вишеструких (>3) микроскопских поља које је прегледао патолог.
Узети заједно, наши резултати показују потенцијалну вредност биомаркера серумских метаболита у диференцијалној дијагнози плућних нодула, што може представљати изазов приликом процене ЦТ скрининга.
На основу валидираног диференцијалног панела метаболита, настојали смо да идентификујемо биолошке корелате главних метаболичких промена. Анализа обогаћивања KEGG путање коју је спровео MetaboAnalyst идентификовала је 6 заједничких значајно измењених путева између две дате групе (LA наспрам HC и LA наспрам BN, прилагођено p ≤ 0,001, ефекат > 0,01). Ове промене су окарактерисане поремећајима у метаболизму пирувата, метаболизму триптофана, метаболизму ниацина и никотинамида, гликолизи, TCA циклусу и метаболизму пурина (Слика 5а). Затим смо додатно извршили циљану метаболомику како бисмо верификовали главне промене користећи апсолутну квантификацију. Одређивање уобичајених метаболита у уобичајено измењеним путевима помоћу троструке квадруполне масене спектрометрије (QQQ) користећи аутентичне стандарде метаболита. Демографске карактеристике циљног узорка студије метаболомике укључене су у Додатну табелу 4. У складу са нашим глобалним резултатима метаболомике, квантитативна анализа је потврдила да су хипоксантин и ксантин, пируват и лактат били повећани у ЛА у поређењу са БН и ХЦ (Сл. 5б, ц, p <0,05). Међутим, нису пронађене значајне разлике у овим метаболитима између БН и ХЦ.
Анализа обогаћивања KEGG путање значајно различитих метаболита у LA групи у поређењу са BN и HC групама. Коришћен је двострани Глобални тест, а p вредности су прилагођене коришћењем Холм-Бонферонијеве методе (прилагођено p ≤ 0,001 и величина ефекта > 0,01). б–д Виолински дијаграми који приказују нивое хипоксантина, ксантина, лактата, пирувата и триптофана у серумским HC, BN и LA одређеним LC-MS/MS (n = 70 по групи). Беле и црне испрекидане линије означавају медијану и квартил, респективно. е Виолински дијаграм који приказује нормализовану Log2TPM (транскрипти на милион) експресију мРНК SLC7A5 и QPRT у аденокарциному плућа (n = 513) у поређењу са нормалним ткивом плућа (n = 59) у LUAD-TCGA скупу података. Бели оквир представља интерквартилни распон, хоризонтална црна линија у центру представља медијану, а вертикална црна линија која се протеже од оквира представља 95% интервал поверења (CI). f Пирсонов корелациони графикон експресије SLC7A5 и GAPDH у аденокарциному плућа (n = 513) и нормалном плућном ткиву (n = 59) у TCGA скупу података. Сива област представља 95% CI. r, Пирсонов коефицијент корелације. g Нормализовани ћелијски нивои триптофана у ћелијама А549 трансфектованим неспецифичном shRNA контролом (NC) и shSLC7A5 (Sh1, Sh2) одређени LC-MS/MS. Приказана је статистичка анализа пет биолошки независних узорака у свакој групи. h ћелијски нивои NADt (укупни NAD, укључујући NAD+ и NADH) у ћелијама А549 (NC) и ћелијама А549 са нокдауном SLC7A5 (Sh1, Sh2). Приказана је статистичка анализа три биолошки независна узорка у свакој групи. i Гликолитичка активност ћелија А549 пре и после обарања SLC7A5 мерена је брзином екстрацелуларне киселости (ECAR) (n = 4 биолошки независна узорка по групи). 2-DG,2-деокси-D-глукоза. Двострани Студентов t-тест је коришћен у (b–h). У (g–i), грешке представљају средњу вредност ± SD, сваки експеримент је изведен три пута независно и резултати су били слични. Изворни подаци су дати у облику изворних датотека.
Узимајући у обзир значајан утицај измењеног метаболизма триптофана у ЛА групи, такође смо проценили нивое триптофана у серуму у HC, BN и LA групама користећи QQQ. Открили смо да је серумски триптофан смањен у ЛА у поређењу са HC или BN (p < 0,001, слика 5д), што је у складу са претходним налазима да су нивои триптофана у циркулацији нижи код пацијената са раком плућа него код здравих контрола из контролне групе33,34,35. Друга студија која је користила ПЕТ/ЦТ трасер 11C-метил-L-триптофан открила је да је време задржавања сигнала триптофана у ткиву рака плућа значајно повећано у поређењу са бенигним лезијама или нормалним ткивом36. Претпостављамо да смањење триптофана у серуму ЛА може одражавати активно усвајање триптофана од стране ћелија рака плућа.
Такође је познато да је крајњи производ кинуренинског пута катаболизма триптофана NAD+37,38, који је важан супстрат за реакцију глицералдехид-3-фосфата са 1,3-бисфосфоглицератом у гликолизи39. Док су се претходне студије фокусирале на улогу катаболизма триптофана у имунолошкој регулацији, ми смо покушали да разјаснимо међусобну интеракцију између дисрегулације триптофана и гликолитичких путева примећених у овој студији. Познато је да је члан 5 породице транспортера растворених супстанци 7 (SLC7A5) транспортер триптофана43,44,45. Фосфорибозилтрансфераза хинолинске киселине (QPRT) је ензим који се налази низводно од кинуренинског пута који претвара хинолинску киселину у NAMN46. Инспекција LUAD TCGA скупа података открила је да су и SLC7A5 и QPRT значајно повећани у туморском ткиву у поређењу са нормалним ткивом (Сл. 5е). Ово повећање је примећено у стадијумима I и II, као и у стадијумима III и IV аденокарцинома плућа (додатна слика 11), што указује на ране поремећаје у метаболизму триптофана повезане са туморогенезом.
Поред тога, скуп података LUAD-TCGA показао је позитивну корелацију између експресије SLC7A5 и GAPDH mRNA у узорцима пацијената оболелих од рака (r = 0,45, p = 1,55E-26, слика 5f). Насупрот томе, није пронађена значајна корелација између таквих генских потписа у нормалном плућном ткиву (r = 0,25, p = 0,06, слика 5f). Смањење експресије SLC7A5 (додатна слика 12) у ћелијама A549 значајно је смањило ћелијске нивое триптофана и NAD(H) (слика 5g,h), што је резултирало смањеном гликолитичком активношћу мереном брзином екстрацелуларне киселости (ECAR) (слика 1). 5i). Стога, на основу метаболичких промена у серуму и in vitro детекције, претпостављамо да метаболизам триптофана може произвести NAD+ путем кинуренина и играти важну улогу у промоцији гликолизе код рака плућа.
Студије су показале да велики број неодређених плућних нодула откривених LDCT-ом може довести до потребе за додатним тестирањем као што су PET-CT, биопсија плућа и прекомерно лечење због лажно позитивне дијагнозе малигнитета.31 Као што је приказано на слици 6, наша студија је идентификовала панел серумских метаболита са потенцијалном дијагностичком вредношћу који могу побољшати стратификацију ризика и накнадно лечење плућних нодула откривених CT-ом.
Плућни нодули се процењују коришћењем компјутеризоване томографије ниских доза (LDCT) са карактеристикама снимања које указују на бенигне или малигне узроке. Неизвестан исход код нодула може довести до честих контролних прегледа, непотребних интервенција и прекомерног лечења. Укључивање серумских метаболичких класификатора са дијагностичком вредношћу може побољшати процену ризика и накнадно лечење плућних нодула. ПЕТ позитронска емисиона томографија.
Подаци из америчке NLST студије и европске NELSON студије указују на то да скрининг група високог ризика помоћу компјутеризоване томографије ниских доза (LDCT) може смањити морталитет од рака плућа1,3. Међутим, процена ризика и накнадно клиничко лечење великог броја случајно откривених плућних нодула помоћу LDCT-а остају највећи изазов. Главни циљ је оптимизација исправне класификације постојећих протокола заснованих на LDCT-у укључивањем поузданих биомаркера.
Одређени молекуларни биомаркери, као што су метаболити у крви, идентификовани су поређењем рака плућа са здравим контролама15,17. У овој студији, фокусирали смо се на примену анализе метаболомике серума како бисмо разликовали бенигне и малигне плућне нодуле случајно откривене ЛДЦТ-ом. Упоредили смо глобални метаболом серума здравих контрола (ЗК), бенигних плућних нодула (БН) и узорака аденокарцинома плућа (ЛК) стадијума I користећи УПЛЦ-ХРМС анализу. Открили смо да ЗК и БН имају сличне метаболичке профиле, док је ЛК показао значајне промене у поређењу са ЗК и БН. Идентификовали смо два сета метаболита у серуму који разликују ЛК од ЗК и БН.
Тренутна шема идентификације бенигних и малигних нодула заснована на LDCT-у углавном се заснива на величини, густини, морфологији и брзини раста нодула током времена30. Претходне студије су показале да је величина нодула уско повезана са вероватноћом рака плућа. Чак и код пацијената са високим ризиком, ризик од малигнитета у чворовима <6 мм је <1%. Ризик од малигнитета за нодуле величине 6 до 20 мм креће се од 8% до 64%30. Стога, Флајшнерово друштво препоручује гранични пречник од 6 мм за рутинско CT праћење.29 Међутим, процена ризика и лечење неодређених плућних нодула (IPN) већих од 6 мм нису адекватно спроведени31. Тренутно лечење конгениталних срчаних мана обично се заснива на будном чекању са честим CT праћењем.
На основу валидираног метаболома, први пут смо показали преклапање метаболомских потписа између здравих особа и бенигних нодула <6 мм. Биолошка сличност је у складу са претходним налазима ЦТ-а да је ризик од малигнитета за нодуле <6 мм једнако низак као и код испитаника без чворова.30 Треба напоменути да наши резултати такође показују да бенигни нодули <6 мм и ≥6 мм имају велику сличност у метаболомским профилима, што сугерише да је функционална дефиниција бенигне етиологије конзистентна без обзира на величину нодула. Стога, модерни дијагностички панели серумских метаболита могу пружити јединствени тест као тест искључивања када се нодули почетно открију на ЦТ-у и потенцијално смањити серијско праћење. Истовремено, исти панел метаболичких биомаркера разликовао је малигне нодуле величине ≥6 мм од бенигних нодула и пружио тачна предвиђања за интернуклеарне неуралгије (ИН) сличне величине и двосмислених морфолошких карактеристика на ЦТ сликама. Овај класификатор серумског метаболизма добро се показао у предвиђању малигнитета нодула ≥6 мм са AUC од 0,927. Узети заједно, наши резултати указују да јединствени серумски метаболомички потписи могу специфично одражавати ране метаболичке промене изазване тумором и имати потенцијалну вредност као предиктори ризика, независно од величине чворића.
Приметно је да су аденокарцином плућа (LUAD) и сквамозноћелијски карцином (LUSC) главни типови неситноћелијског карцинома плућа (NSCLC). С обзиром на то да је LUSC снажно повезан са употребом дувана47 и да је LUAD најчешћа хистологија случајно откривених плућних нодула на ЦТ скринингу48, наш модел класификације је посебно направљен за узорке аденокарцинома стадијума I. Ванг и колеге су се такође фокусирали на LUAD и идентификовали девет липидних потписа користећи липидомику како би разликовали рак плућа у раном стадијуму од здравих особа17. Тестирали смо тренутни модел класификације на 16 случајева LUSC стадијума I и 74 бенигна нодула и приметили ниску тачност предвиђања LUSC (AUC 0,776), што сугерише да LUAD и LUSC могу имати сопствене метаболомске потписе. Заиста, показало се да се LUAD и LUSC разликују по етиологији, биолошком пореклу и генетским аберацијама49. Стога, друге врсте хистологије треба укључити у моделе обуке за откривање рака плућа на нивоу популације у програмима скрининга.
Овде смо идентификовали шест најчешће измењених метаболичких путева код аденокарцинома плућа у поређењу са здравим контролама и бенигним чворићима. Ксантин и хипоксантин су уобичајени метаболити метаболичког пута пурина. У складу са нашим резултатима, међупроизводи повезани са метаболизмом пурина били су значајно повећани у серуму или ткивима пацијената са аденокарциномом плућа у поређењу са здравим контролама или пацијентима у преинвазивној фази15,50. Повишени нивои ксантина и хипоксантина у серуму могу одражавати анаболизам који је потребан брзо пролиферирајућим ћелијама рака. Дисрегулација метаболизма глукозе је добро познати обележје метаболизма рака51. Овде смо приметили значајно повећање пирувата и лактата у ЛА групи у поређењу са ХЦ и БН групом, што је у складу са претходним извештајима о абнормалностима гликолитичког пута у профилима метаболома серума пацијената са неситноћелијским карциномом плућа (НСЦЛЦ) и здравих контрола. Резултати су конзистентни52,53.
Важно је напоменути да смо уочили инверзну корелацију између метаболизма пирувата и триптофана у серуму плућних аденокарцинома. Нивои серумског триптофана били су смањени у ЛА групи у поређењу са ХЦ или БН групом. Занимљиво је да је претходна велика студија која је користила проспективну кохорту открила да су ниски нивои циркулишућег триптофана повезани са повећаним ризиком од рака плућа 54. Триптофан је есенцијална аминокиселина коју у потпуности добијамо из хране. Закључујемо да смањење серумског триптофана код плућног аденокарцинома може одражавати брзо смањење овог метаболита. Добро је познато да је крајњи производ катаболизма триптофана путем кинуренинског пута извор de novo синтезе NAD+. Пошто се NAD+ производи првенствено путем спасавања, значај NAD+ у метаболизму триптофана у здрављу и болести тек треба да се утврди46. Наша анализа TCGA базе података показала је да је експресија транспортера триптофана, раствореног транспортера 7A5 (SLC7A5), значајно повећана код аденокарцинома плућа у поређењу са нормалним контролама и да је позитивно корелирана са експресијом гликолитичког ензима GAPDH. Претходне студије су се углавном фокусирале на улогу катаболизма триптофана у сузбијању антитуморског имуног одговора40,41,42. Овде показујемо да инхибиција апсорпције триптофана смањењем SLC7A5 у ћелијама рака плућа доводи до накнадног смањења ћелијских нивоа NAD и пратећег слабљења гликолитичке активности. Укратко, наша студија пружа биолошку основу за промене у метаболизму серума повезане са малигном трансформацијом аденокарцинома плућа.
ЕГФР мутације су најчешће покретачке мутације код пацијената са НСЛЦ. У нашој студији, открили смо да пацијенти са ЕГФР мутацијом (н = 41) имају укупне метаболомичке профиле сличне пацијентима са дивљим типом ЕГФР (н = 31), иако смо пронашли смањене серумске нивое неких пацијената са ЕГФР мутантом код пацијената са ацилкарнитином. Утврђена функција ацилкарнитина је транспорт ацил група из цитоплазме у митохондријални матрикс, што доводи до оксидације масних киселина ради производње енергије 55. У складу са нашим налазима, недавна студија је такође идентификовала сличне профиле метаболома између ЕГФР мутантних и ЕГФР дивљег типа тумора анализирајући глобални метаболом 102 узорка ткива плућног аденокарцинома 50. Занимљиво је да је садржај ацилкарнитина такође пронађен у групи са ЕГФР мутантом. Стога, да ли промене у нивоима ацилкарнитина одражавају метаболичке промене изазване ЕГФР-ом и основне молекуларне путеве, може заслужити даља истраживања.
Закључно, наша студија успоставља серумски метаболички класификатор за диференцијалну дијагнозу плућних нодула и предлаже ток рада који може оптимизовати процену ризика и олакшати клиничко лечење на основу ЦТ скенирања.
Ову студију је одобрио Етички комитет Онколошке болнице Универзитета Сун Јат-сен, Прва придружена болница Универзитета Сун Јат-сен и Етички комитет Онколошке болнице Универзитета Џенгџоу. У групама за откривање и интерну валидацију, 174 серума од здравих особа и 244 серума из бенигних чворића прикупљено је од особа које су се подвргавале годишњим лекарским прегледима на Одељењу за контролу и превенцију рака, Онколошког центра Универзитета Сун Јат-сен, и 166 бенигних чворића. Аденокарциноми плућа стадијума I прикупљени су из Онколошког центра Универзитета Сун Јат-сен. У кохорти за екстерну валидацију, било је 48 случајева бенигних чворића, 39 случајева аденокарцинома плућа стадијума I из Прве придружене болнице Универзитета Сун Јат-сен и 24 случаја аденокарцинома плућа стадијума I из Онколошке болнице Џенгџоу. Онколошки центар Универзитета Сун Јат-сен такође је прикупио 16 случајева сквамозног ћелијског карцинома плућа стадијума I како би се тестирала дијагностичка способност утврђеног метаболичког класификатора (карактеристике пацијената су приказане у Додатној табели 5). Узорци из кохорте за откривање и кохорте за интерну валидацију прикупљени су између јануара 2018. и маја 2020. Узорци за кохорту за екстерну валидацију прикупљени су између августа 2021. и октобра 2022. Да би се минимизирала родна пристрасност, свакој кохорти је додељен приближно једнак број мушких и женских случајева. Тим за откривање и тим за интерну рецензију. Пол учесника је одређен на основу самопријављивања. Информисани пристанак је добијен од свих учесника и није обезбеђена никаква надокнада. Субјекти са бенигним чворићима били су они са стабилним резултатом ЦТ скенирања након 2 до 5 година у време анализе, осим 1 случаја из узорка за екстерну валидацију, који је прикупљен преоперативно и дијагностикован хистопатологијом. Са изузетком хроничног бронхитиса. Случајеви аденокарцинома плућа прикупљени су пре ресекције плућа и потврђени патолошком дијагнозом. Узорци крви на гладно су прикупљени у епрувете за сепарацију серума без икаквих антикоагуланса. Узорци крви су згрушани 1 сат на собној температури, а затим центрифугирани на 2851 × g током 10 минута на 4°C да би се сакупио серумски супернатант. Аликвоти серума су замрзнути на -80°C до екстракције метаболита. Одељење за превенцију рака и медицински преглед Центра за рак Универзитета Сун Јат-сен прикупило је узорке серума од 100 здравих донора, укључујући једнак број мушкараца и жена старости од 40 до 55 година. Једнаке запремине сваког узорка донора су помешане, резултујући узорак је аликвотиран и чуван на -80°C. Смеша серума је коришћена као референтни материјал за контролу квалитета и стандардизацију података.
Референтни серум и тест узорци су одмрзнути, а метаболити су екстраховани коришћењем комбиноване методе екстракције (MTBE/метанол/вода) 56. Укратко, 50 μl серума је помешано са 225 μl ледено хладног метанола и 750 μl ледено хладног метил терт-бутил етра (MTBE). Смеша је промешана и инкубирана на леду 1 сат. Узорци су затим помешани и вортексовани са 188 μl воде MS квалитета која садржи интерне стандарде (13C-лактат, 13C3-пируват, 13C-метионин и 13C6-изолеуцин, купљени од Cambridge Isotope Laboratories). Смеша је затим центрифугирана на 15.000 × g током 10 минута на 4 °C, а доња фаза је пренета у две епрувете (по 125 μL) за LC-MS анализу у позитивном и негативном режиму. Коначно, узорак је испарен до сувог стања у вакуумском концентратору велике брзине.
Осушени метаболити су реконституисани у 120 μl 80% ацетонитрила, вортексовани 5 минута и центрифугирани на 15.000 × g током 10 минута на 4°C. Супернатанти су пребачени у ћилибарне стаклене бочице са микроинсертима за метаболомичке студије. Нециљана метаболомичка анализа на платформи ултра-перформансне течне хроматографије-масене спектрометрије високе резолуције (UPLC-HRMS). Метаболити су раздвојени коришћењем Dionex Ultimate 3000 UPLC система и ACQUITY BEH Amide колоне (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). У режиму позитивних јона, мобилне фазе су биле 95% (А) и 50% ацетонитрила (Б), свака садржајући 10 mmol/L амонијум ацетата и 0,1% мравље киселине. У негативном режиму, мобилне фазе А и Б су садржале 95% и 50% ацетонитрила, респективно, обе фазе су садржале 10 mmol/L амонијум ацетата, pH = 9. Градијентни програм је био следећи: 0–0,5 мин, 2% B; 0,5–12 мин, 2–50% B; 12–14 мин, 50–98% B; 14–16 мин, 98% B; 16–16,1 мин, 98–2% B; 16,1–20 мин, 2% B. Колона је одржавана на 40°C, а узорак на 10°C у аутоматском узорковачу. Брзина протока је била 0,3 ml/min, запремина убризгавања је била 3 μl. Q-Exactive Orbitrap масени спектрометар (Thermo Fisher Scientific) са извором електроспреј јонизације (ESI) је радио у режиму пуног скенирања и повезан је са ddMS2 режимом праћења ради прикупљања великих количина података. Параметри MS су подешени на следећи начин: напон прскања +3,8 kV/- 3,2 kV, температура капиларе 320°C, заштитни гас 40 arb, помоћни гас 10 arb, температура грејача сонде 350°C, опсег скенирања 70–1050 m/h, резолуција 70 000. Подаци су прикупљени помоћу Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Да би се проценио квалитет података, генерисани су обједињени узорци контроле квалитета (QC) узимањем аликвота од 10 μL супернатанта из сваког узорка. Шест ињекција узорака контроле квалитета анализирано је на почетку аналитичке секвенце како би се проценила стабилност UPLC-MS система. Узорци контроле квалитета се затим периодично уносе у серију. Свих 11 серија узорака серума у овој студији анализирано је LC-MS методом. Аликвоти смеше обједињеног серума од 100 здравих донора коришћени су као референтни материјал у одговарајућим серијама за праћење процеса екстракције и прилагођавање ефектима од серије до серије. Нециљана метаболомичка анализа кохорте за откриће, интерне валидационе кохорте и екстерне валидационе кохорте спроведена је у Центру за метаболомику Универзитета Сун Јат-сен. Екстерна лабораторија Центра за анализу и тестирање Технолошког универзитета Гуангдонг такође је анализирала 40 узорака из екстерне кохорте како би тестирала перформансе модела класификатора.
Након екстракције и реконституције, апсолутна квантификација серумских метаболита мерена је коришћењем ултра-високо ефикасне течне хроматографије-тандем масене спектрометрије (Agilent 6495 троструки квадрупол) са извором електроспреј јонизације (ESI) у режиму вишеструког праћења реакција (MRM). За раздвајање метаболита коришћена је ACQUITY BEH Амидна колона (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Мобилна фаза се састојала од 90% (А) и 5% ацетонитрила (Б) са 10 mmol/L амонијум ацетата и 0,1% раствора амонијака. Градијентни програм је био следећи: 0–1,5 мин, 0% Б; 1,5–6,5 мин, 0–15% Б; 6,5–8 мин, 15% Б; 8–8,5 мин, 15%–0% Б; 8,5–11,5 мин, 0% Б. Колона је одржавана на 40 °C, а узорак на 10 °C у аутоматском узорковачу. Брзина протока је била 0,3 mL/min, а запремина убризгавања 1 μL. MS параметри су подешени на следећи начин: капиларни напон ±3,5 kV, притисак у небулизатору 35 psi, проток гаса омотача 12 L/min, температура гаса омотача 350 °C, температура гаса за сушење 250 °C и проток гаса за сушење 14 l/min. MRM конверзије триптофана, пирувата, лактата, хипоксантина и ксантина биле су 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 и 151,0–107,9 респективно. Подаци су прикупљени помоћу Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). За узорке серума, триптофан, пируват, лактат, хипоксантин и ксантин су квантификовани коришћењем калибрационих кривих стандардних раствора смеша. За узорке ћелија, садржај триптофана је нормализован на интерни стандард и масу ћелијских протеина.
Екстракција пика (m/z и време задржавања (RT)) је извршена коришћењем Compound Discovery 3.1 и TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Да би се елиминисале потенцијалне разлике између серија, сваки карактеристични пик тестираног узорка је подељен карактеристичним пиком референтног материјала из исте серије да би се добила релативна количина. Релативне стандардне девијације интерних стандарда пре и после стандардизације су приказане у Додатној табели 6. Разлике између две групе су окарактерисане стопом лажних открића (FDR<0,05, Wilcoxon signed rank test) и променом прегиба (>1,2 или <0,83). Сирови MS подаци екстрахованих карактеристика и MS подаци кориговани референтним серумом су приказани у Додатним подацима 1 и Додатним подацима 2, респективно. Анотација пика је извршена на основу четири дефинисана нивоа идентификације, укључујући идентификоване метаболите, наводно анотирана једињења, наводно окарактерисане класе једињења и непозната једињења 22. На основу претрага базе података у Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), биолошка једињења са MS/MS подударајућим валидираним стандардима или анотацијама тачног подударања у mzCloud (скор > 85) или Chemspider су коначно одабрана као посредници између диференцијалног метаболома. Анотације пикова за сваку карактеристику су укључене у Додатне податке 3. MetaboAnalyst 5.0 је коришћен за униваријантну анализу обиља метаболита нормализоване сумом. MetaboAnalyst 5.0 је такође проценио анализу обогаћивања KEGG путање на основу значајно различитих метаболита. Анализа главних компоненти (PCA) и дискриминантна анализа парцијалних најмањих квадрата (PLS-DA) су анализиране коришћењем софтверског пакета ropls (в.1.26.4) са нормализацијом стека и аутоматским скалирањем. Оптимални модел биомаркера метаболита за предвиђање малигнитета нодула је генерисан коришћењем бинарне логистичке регресије са најмањим апсолутним смањењем и оператором селекције (LASSO, R пакет в.4.1-3). Перформансе дискриминантног модела у скуповима за детекцију и валидацију окарактерисане су проценом AUC на основу ROC анализе према pROC пакету (v.1.18.0). Оптимална гранична вредност вероватноће добијена је на основу максималног Јуденовог индекса модела (сензитивност + специфичност – 1). Узорци са вредностима мањим или већим од прага биће предвиђени као бенигни нодули и аденокарцином плућа, респективно.
Ћелије А549 (#CCL-185, Америчка колекција типових култура) су гајене у F-12K медијуму који садржи 10% FBS. Секвенце кратких укосница РНК (shRNA) које циљају SLC7A5 и контролну групу која не циља (NC) су уметнуте у лентивирусни вектор pLKO.1-puro. Антисенс секвенце shSLC7A5 су следеће: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Антитела на SLC7A5 (#5347) и тубулин (#2148) су купљена од Cell Signaling Technology. Антитела на SLC7A5 и тубулин су коришћена у разблажењу 1:1000 за Western blot анализу.
Seahorse XF гликолитички стрес тест мери нивое екстрацелуларне ацидификације (ECAR). У тесту, глукоза, олигомицин А и 2-DG су секвенцијално примењивани да би се тестирао ћелијски гликолитички капацитет мерено ECAR-ом.
Ћелије А549 трансфектоване контролом која није циљала (NC) и shSLC7A5 (Sh1, Sh2) су посејане преко ноћи у посуде пречника 10 cm. Ћелијски метаболити су екстраховани са 1 ml ледено хладног 80% воденог раствора метанола. Ћелије у раствору метанола су састругане, сакупљене у нову епрувету и центрифугиране на 15.000 × g током 15 минута на 4°C. Сакупити 800 µl супернатанта и осушити помоћу брзог вакуумског концентратора. Осушене пелете метаболита су затим анализиране на нивое триптофана коришћењем LC-MS/MS као што је горе описано. Ћелијски нивои NAD(H) у ћелијама А549 (NC и shSLC7A5) су мерени коришћењем квантитативног колориметријског комплета NAD+/NADH (#K337, BioVision) према упутствима произвођача. Нивои протеина су мерени за сваки узорак да би се нормализовала количина метаболита.
Нису коришћене статистичке методе за прелиминарно одређивање величине узорка. Претходне метаболомичке студије усмерене на откривање биомаркера15,18 сматране су референтним вредностима за одређивање величине, и у поређењу са овим извештајима, наш узорак је био адекватан. Ниједан узорак није искључен из студијске кохорте. Узорци серума су насумично распоређени у групу за откривање (306 случајева, 74,6%) и интерну групу за валидацију (104 случаја, 25,4%) за нециљане метаболомичке студије. Такође смо насумично одабрали 70 случајева из сваке групе из скупа за откривање за циљане метаболомичке студије. Истраживачи нису били упознати са распоредом у групе током прикупљања и анализе података LC-MS. Статистичке анализе метаболомичких података и ћелијских експеримената описане су у одговарајућим одељцима Резултати, Легенде слика и Методе. Квантификација ћелијског триптофана, NADT-а и гликолитичке активности извршена је три пута независно са идентичним резултатима.
За више информација о дизајну студије, погледајте сажетак извештаја о природном портфолију повезан са овим чланком.
Необрађени MS подаци екстрахованих карактеристика и нормализовани MS подаци референтног серума приказани су у Додатним подацима 1 и Додатним подацима 2, респективно. Анотације пикова за диференцијалне карактеристике представљене су у Додатним подацима 3. LUAD TCGA скуп података може се преузети са https://portal.gdc.cancer.gov/. Улазни подаци за цртање графика дати су у изворним подацима. Изворни подаци су дати за овај чланак.
Национална група за проучавање скрининга плућа, итд. Смањење морталитета од рака плућа помоћу компјутеризоване томографије ниских доза. Северна Енглеска. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Крамер, БС, Берг, КД, Аберле, ДР и Профет, ПЦ Скрининг рака плућа коришћењем хеликоске компјутеризоване томографије са ниским дозама: резултати Националне студије скрининга плућа (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
Де Конинг, ХЈ и др. Смањење морталитета од рака плућа волуметријским ЦТ скринингом у рандомизованом испитивању. Северна Енглеска. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Време објаве: 18. септембар 2023.